4.5. Конформационные свойства ферментов

Основная идея состоит в определяющей роли конформационной лабильности взаимодействующих молекул для ферментативного катализа.

Ряд ферментов в присутствии S становятся более жёсткими, другие — более лабильными (легче денатурируют при нагревании), изменяются α-спирали, изменения можно обнаружить методом ЭПР, также изменяются спектры люминесценции и т.д.

Рентгенография ФСК даёт прямую информацию о конформационных превращениях. При вхождении аналога субстрата S глицилтирозина в полость карбоксипептидазы полость сужается и более плотно зажимает субстрат. Изменяется и субстрат. "Щупальца" направляют субстрат к кофактору Zn.

Методы рентгенодинамического анализа, мессбауэровской спектроскопии, рэлеевского рассеяния мессбауэровского излучения показали, что конформационная подвижность в белках сохраняется и при низких Т.

В ФСК достигается структурное соответствие, реализуемое в полости фермента. Внутренняя поверхность полости образована преимущественно неполярными остатками. Из-за гидрофобного взаимодействия полярные остатки остаются снаружи. Неполярное "нутро" белковой молекулы имеет малую диэлектрическую проницаемость (порядка 3), что облегчает электрические взаимодействия. Неполярные внутренние области ферментов обеспечивают живую клетку эквивалентами органических растворителей.

Но в целом теория поля не создана.

4.6. Физика фермент-субстратного взаимодействия

1. Электростатические взаимодействия.

Физические особенности определяются белковой глобулой, которая по размерам больше субстрата. При сорбции S находится в полости с малой ε, т.е. там, где могут реализоваться сильные электростатические взаимодействия между реагентами и полярными группами фермента. Перутц считает, что это даёт главный вклад в энергетику ферментативного катализа, т.е. в понижение энергии активации. Отличие фермента от водного раствора состоит в том, что в активном центре АЦ фермента располагаются диполи с фиксированной ориентацией по отношению к заряженным группам субстрата, даже если поле этих зарядов мало. Вследствие такой ориентации ферменты могут стабилизировать пары ионов и другие распределения зарядов значительно лучше, чем H₂O. В водных растворах электростатическое притяжение невелико, т.к. любая сила, создаваемая сближением противоположных зарядов, уравновешивается ориентацией диполей растворителя. В ферментах такая переориентация невозможна. Количественные расчёты на этой основе согласуются с экспериментом (снижение энергии активации для лизоцима).

2. При сорбции субстрата выделяется энергия. Предполагается, что она накапливается и идёт на упругие колебания глобулы, ведущей себя подобно капле жидкости. Частоты таких колебаний попадают в гиперзвуковую область и достигают 10^-13 с^-1. Энергия этих колебаний может активировать молекулу субстрата S. Расчёты показали, что энергия упругих колебаний глобулы может достигать 20-40 кДж/моль и обеспечивать значительное понижение эффективного активационного барьера. Но экспериментальных доказательств у гипотезы нет.

Стоячие волны в капле могут образовывать пучность в области активного центра и энергия упругих колебаний может активировать S. Но неясно, с какой скоростью энергия глобулы диссипирует в окружающую среду.

Оценим ускорение реакции при трансформации энергии сорбции в энергию ФСК. Для начала, предположим, что структурное соответствие фермент-субстрат в ФСК приводит и фермент, и субстрат в напряжённое состояние ("модель дыбы"). Пусть L₀ — длина нерастянутой молекулы S, а L — длина полости фермента (Ф), в которую вошёл S. Изменения длины молекул S и Ф равны x и y. Тогда х + у=L - L₀ и условие равенства упругих сил приобретёт вид:

k_s и k_e — коэффициенты упругости S и Ф. Находим

; .

Упругая энергия субстрата, определяющая понижение энергии активации равна: .

Порядок .

L — линейный размер глобулы, ε — модуль упругости глобулы. Для белка L ≈ 5 нм, е ≈ 10³ Дж/см³ , значит k_e ≈ 5∙10^-2 Н/см.

Наибольшая энергия упругой деформации сосредотачивается в наиболее слабом месте молекулы S. Деформация валентных углов происходит легче, чем валентных связей. Вместе с тем, энергия, запасённая на угловых степенях свободы молекулы, может "перейти" на валентную связь и уменьшить энергию активации её разрыва. k_s, отвечающий низкочастотным деформационным колебаниям (ν ≈ 10¹³ с^-1), равен ≈ 0,15 Н/см. Допустим, что ∆Е = 31,5 кДж/моль (при уменьшении энергии активации на такую величину скорость реакции увеличивается в 10⁵ раз). Тогда х ≈ 0,08 нм, у ≈ 0,23 нм, упругая энергия фермента

.

Значит, суммарная энергия расходуется при сорбции на упругую деформацию, составляет 171 кДж/моль. Это не столь высокая Е, если учесть что сорбция происходит за счёт многоточечного связывания, т.е. образования многих химических и слабых связей между Ф и S. Наблюдаемая энергия сорбции представляет собой разность истинной энергии сорбции и энергии упругой деформации Ф и S.

Модель "дыбы" — статическая. Если предположить, что упругая система является динамической и возникает резонанс колебаний молекул S и Ф, то для такого же ускорения реакции потребуется средняя упругая энергия в 4 раза меньше, чем в статическом случае, т.к. биения периодически удваивают амплитуду колебаний.

3. В таких процессах рассматриваются колебания атомных ядер, возникающих при образовании ФСК. При взаимодействии Ф с S изменяются состояния электронных оболочек субстрата и атомных групп активного центра. Электронные оболочки испытывают возмущение вследствие взаимодействий в ФСК. Превращение S в P (продукт) — это химический процесс, т.е. изменение состояния электронных оболочек молекул. При этом происходит перемещение атомных ядер, среди которых наименьшей энергии требуют низкочастотные деформационные колебания и повороты вокруг единичных связей, т.е. изменение конформаций. Для ферментативного катализа важнейшее значение имеют взаимодействия электронных и конформационных степеней свободы — ЭКВ.