43. Спектрометрия ямр. Применение в фармацевтическом анализе.

Спектроскопи́я я́дерного магни́тного резона́нса, ЯМР-спектроскопия — спектроскопический метод исследования химических объектов, использующий явление ядерного магнитного резонанса. Наиболее важными для химии и практических применений являются спектроскопия протонного магнитного резонанса (ПМР-спектроскопия), а также спектроскопия ЯМР на ядрах углерода-13 (13C ЯМР-спектроскопия), фтора-19 (19F ЯМР-спектроскопия), фосфора-31 (31P ЯМР-спектроскопия). ЯМР-спектрометр для спектрометрии непрерывного действия состоит из магнита, генератора низкочастотного разрешения, держателя образца, радиочастотных выпрямителей и приемника, регистрирующего устройства и электронного интегратора. Импульсный спектрометр снабжается кроме этого импцульсным выпрямителем и компьютером для сбора, хранения и математического преобразования данных к спектру обычного вида.Подобно инфракрасной спектроскопии, ЯМР выявляет информацию о молекулярном строении химических веществ. Однако, он обеспечивает более полную информацию, чем ИС, позволяя изучать динамические процессы в образце — определять константы скорости химических реакций, величину энергетических барьеров внутримолекулярного вращения. Эти особенности делают ЯМР-спектроскопию удобным средством как в теоретической органической химии, так и для анализа биологических объектов.

Для качественного анализа c помощью ЯМР используют анализ спектров, основанный на: сигналах ядер атомов, входящих в определенные функциональные группы, лежат в строго определенных участках спектра; интегральная площадь, ограниченная пиком, строго пропорциональна количеству резонирующих атомов; ядра, лежащие через 1-4 связи, способны давать мультиплетные сигналы в результате т. н. расщепления друг на друге.

Явление ЯМР заключается в резонансном поглощении энергии радиочастотного поля системой магнитных ядер, помещенных в постоянное магнитное поле Н_о. Магнитное поле ядра со спином 1=1/2, помещен­ное в постоянное магнитное поле, характеризуется двумя магнитными уровнями. При наложении радиочастотного поля частоты = µ_о, (где = µ/(h*l) - гиромагнитное отношение ядра), совпадающей с резонан­сной частотой ядра, наблюдаются переходы между ядерными уровнями. Переходы будут сопровождаться поглощением энергии радиочастотного поля, и сигналы поглощения будут фиксироваться в ЯМР-спектрах. Полученные сигналы резонирующих магнитных ядер удобно связывать со структурными параметрами молекулы.

Основные параметры ЯМР-спектра

Химический сдвиг ядра определяет смещение ЯМР - сигнала в зави­симости от распределения электронной плотности на ядре. Ядра, имею­щие одинаковую электронную плотность, называются химически эквива­лентными. В спектре они дают одну линию химического сдвига (напри­мер, протоны метальных групп молекул: ацетона, бензольного кольца, 2,2-диметилпропана). Ядра, имеющие различную электронную плотность, называются химически неэквивалентными. В спектре они дают различ­ные линии химических сдвигов (например, протоны СН,, ОСН₂, ОН - групп в молекуле этанола). Величина химического сдвига (обозначается буквой 5) отсчитывается от специально выбранного стандартного сигнала в миллионных долях приложенного поля (м.д.). Химические сдвиги определяются характером химических связей, индукционными эффек­тами заместителей, электрическими и магнитными эффектами удален­ных групп.

Константа спин-спинового взаимодействия (КССВ) определяет­ся магнитным взаимодействием химически неэквивалентных ядер. Спин-спиновые взаимодействия осуществляются через электронные облака, передаются по химическим связям и проявляются как добавочные рас­щепления линий химических сдвигов. Расстояние между расщепленны­ми сигналами определяется величиной КССВ, измеряемой в Гц, "J. Значок "п" указывает на число связей между взаимодействующими магнит­ными ядрами. Например, ³J _{н с о н}' означает КССВ протонов метильной и гидроксильной групп через³ три связи в молекуле СН₃ОН. Число сигна­лов от спин-спиновых взаимодействий определяется формулой 2n I +1, где п - число магнитных ядер в соседней группе, I - спин ядра. Величина КССВ зависит от магнитных свойств ядер, числа и характера химичес­ких связей между ними, а также природы заместителей. В ряде случаев КССВ зависит от расположения атомов в пространстве - обладает стереоспецифичностью.

Площадь ЯМР-сигнала, или его интегральная интенсивность, соот­ветствует числу магнитных ядер, резонирующих в данной группе. Интеграл спектра записывается в виде ступенчатой кривой, высота ступеньки соответствует числу ядер в рассматриваемой группе и измеряется в миллиметрах.

Большинство последних инноваций в ЯМР спектроскопии сделаны в так называемой ЯМР спектроскопии белков, которая становится очень важной техникой в современной биологии и медицине последующим восстановлением сигнала спада свободной индукции с помощью специальных математических методик.

44. Флуориметрия. Применение в фармацевтическом анализе.

Люминесцентной спектроскопией называют группу эмиссионных спектроскопических методов анализа, основанных на явлении люминесценции.

Флуоресценция - излучательный переход между состояниями, имеющими одинаковую мультиплетность. В подавляющем большинстве случаев флуоресценция сложных органических молекул обусловлена переходом с нулевого колебательного уровня возбуждённого состояния S1 на какой-то из колебательных уровней S0, реже S2→S0 (например, в молекуле азулена) и

очень редко Sk →Sm или Tm →Tn. Флуоресценция - быстрый процесс (10^-9 - 10^-6 с).

Люминесценция и, в частности, флуоресценция в гораздо большей степени подвержена влиянию различных факторов, чем поглощение света. Интенсивность флуоресценции зависит от: природы вещества; концентрации вещества в растворе; условий, в которых находится флуоресцирующее вещество (температура, растворитель, рН, наличие в растворе других веществ, способных влиять на флуоресценцию).

Для измерения интенсивности флуоресценции используют спектрофлуориметры и флуориметры. В качестве источника излучения используют ртутную, ксеноновую и другие лампы. В последнее время для возбуждения флуоресценции применяют лазеры. Для выделения нужного спектрального интервала в флуориметрах, как и в фотоэлектроколориметрах, используют светофильтры, а в спектрофлуориметрах, также как и в спектрофотометрах - монохроматоры (дифракционные решётки или призмы). Светофильтр (монохроматор), используемый для выделения необходимого возбуждающего излучения, называется первичным, а для выделения наиболее интенсивного излучения из спектра испускания - вторичным.

Измерение флуоресценции, в отличие от измерения поглощения, чаще всего проводят под прямым углом к направлению возбуждающего света.По сравнению со спектрофотометрией флуориметрия обладает: большей избирательностью (не все вещества, поглощающие УФ- и видимое излучение, способны флуоресцировать); более низким пределом обнаружения (измерить абсолютную величину малого сигнала всегда легче, чем разность между двумя большими сигналами); удобным временным диапазоном.

Поглощение света - это практически мгновенный процесс (10^-15 -10^-16 с), флуоресценция длится около 10 нс. За это время с молекулой могут произойти различные процессы, которые влияют на характеристики флуоресценции. Данное свойство широко используется в биохимии для изучения строения мембран, диффузии биомолекул, динамики связывания антигенов и

антител. Влияние вращения молекул антигенов (лекарств, ядов), меченых флуоресцеином, на поляризацию флуоресценции последнего лежит в основе поляризационного флуороиммуноанализа, одного из современных методов анализа биологических объектов.

Флуоресцентный анализ используют для обнаружения и для количественного определения веществ. В качественном анализе чаще всего используется способность вещества флуоресцировать тем или иным цветом. В количественном анализе используют зависимость интенсивности флуоресценции от концентрации флуоресцирующего вещества либо, реже, зависимость уменьшения интенсивности флуоресценции от концентрации тушителя, в роли которого выступает вещество, концентрацию которого необходимо определить.

В флуоресцентном анализе используется: измерение собственной флуоресценции вещества; получение флуоресцирующих продуктов, в том числе и экстракционная флуориметрия; определения, основанные на тушении флуоресценции; титрование с флуоресцентными индикаторами и др.

Флуориметрическое определение, основанное на собственной флуоресценции, используется для определения хинина, берберина, рибофлавина, фторхинолонов, флуоресцеина и т.д. Флуориметрическое определение, основанное на тушении флуоресценции, применяют для определения сульфаниламидов (тушат флуоресценцию 9-хлоракридина), β-лактамных антибиотиков (тушат флуоресценцию меркурохрома) и т.д.

45Спектрометрия комбинационного рассеивания, нефелометрия, турбидиметрия. Применение в фармацевтическом анализе.

Комбинационного рассеяния спектроскопия (рамановская спектроскопия), раздел оптической спектроскопии, изучающий взаимодействие монохроматического излучения с веществом, сопровождающееся изменением энергии рассеянного излучения по сравнению с энергией падающего на объект (возбуждающего) излучения. Комбинационное рассеяние (КР) обусловлено неупругими столкновениями фотонов с молекулами (или ионами), в ходе которых они обмениваются энергией. По изменению энергии фотона можно судить об изменении энергии молекулы, то есть о переходе ее на новый энергетический уровень.

Для определения прозрачности и степени мутности жидкостей используют одинаковые пробирки из бесцветного, прозрачного и нейтрального стекла с плоским дном, которые имеют внутренний диаметр от 15 мм до 25 мм. Слой испытуемой жидкости толщиной 40-мм сравнивают с 40-мм слоем свежеприготовленного, как описано ниже, эталона. Сравнение растворов проводят при рассеянном дневном освещении через 5 минут после приготовления эталона, просматривая объекты вдоль вертикальной оси пробирок на черном фоне.

Прозрачными считаются жидкости, которые по прозрачности не отличаются от воды Р или раствора, который используют при приготовлении жидкости в описанных выше условиях, или которые не превышают по интенсивности мутность эталонной суспензии I.

Степень мутности раствора может быть определена с помощью инструментального измерения поглощения или рассеяния света за счет субмикроскопических неоднородностей оптической плотности опалесцирующих растворов и суспензий. На практике используются два метода: нефелометрия и турбидиметрия. Для измерения мутности окрашенных испытуемых образцов можно используовать методы относительной турбидиметрии и нефелометрии с выбором отношения.

В методе нефелометрии измерение проводят под углом 90° к падающему лучу света. Метод основан на том, что определенная часть светового луча, попадающего в мутную жидкость, проходит через нее, другая часть поглощается, а оставшаяся часть рассеивается суспендированными частицами (эффект Тиндаля). Нефелометрические данные более достоверны при низкой мутности суспензий (менее 1750—2000 NTU), когда наблюдается линейная зависимость между значением нефелометрической единицы мутности (NTU) и относительным

сигналом детектора.

Метод турбидиметрии основан на зависимости интенсивности прошедшего света от количества твердых частиц в суспензии. Линейная зависимость между мутностью и концентрацией соблюдается только для очень разведенных суспензий, содержащих маленькие гомогенные частицы. В относительной турбидиметрии находится отношение интенсивности прошедшего света к интенсивности рассеянного света под углом 90°. Проведение такого испытания компенсирует влияние окрашивания испытуемого образ-ца. Этого эффекта можно добиться также за счет использования инфракрасного светоиспускающего диода при длине волны 860 нм. Фотодиодные детекторы прибора получают и измеряют интенсивность рассеянного света под углом 90°, а также интенсивность рассеяния в прямом направлении (отраженный свет) перед испытуемым образцом и интенсивность света, прошедшего через испытуемый образец. Измеренные результаты в единицах NTU (отношение) рассчитываются делением интенсивности рассеянного света под углом 90° на сумму интенсивности рассеяния в прямом направлении и интенсивности прошедшего света. В относительной турбидиметрии влияние постороннего света становится незначительным. Нефелометры используют для измерения степени мутности бесцветных жидкостей.