54.Электрофорез. Капилярный электрорфорез. Применение в фармацевтическом анализе.

Электрофорез — метод анализа, основанный на способности заряженных частиц к перемещению в электрическом поле. Скорость перемещения ионов зависит от напряженности электрического поля, величины заряда, размера частицы, вязкости, pH среды, температуры и других факторов. Электрофоретическая подвижность — величина, характерная для испытуемого вещества. Различают абсолютную (измеряемую в сантиметрах в секунду) и относительную электрофоретическую подвижность (отношение к подвижности стандартного образца). По технике выполнения и аналитическим возможностям электрофорез на бумаге и в тонких слоях сорбента сходен с ТСХ. Он позволяет разделять и идентифицировать компоненты различных смесей.

Под действием электрического поля заряженные частички, растворенные или диспергированные в растворе электролита, передвигаются в направление к электроду противоположной полярности, а молекулы с положительными и отрицательными зарядами передвигаются в направлении их суммарного заряда. Скорость передвижения прямо пропорциональна суммарному заряду частицы и обратно пропорциональна ее размеру, либо молекулярной массе. В гель-электрофорезе движение частиц замедляется взаимодействием с окружающей матрицей геля, что действует как молекулярное сито. Встречные взаимодействия электрической силы и молекулярного сита приводят к диференциации скорости передвижения частиц в зависимости от их размеров, форм и зарядов. В ходе электрофореза из-за различия физико-химических свойств, разные макромолекулярные смеси передвигаются с разной скоростью и, таким образом, разделяются на дискретные фракции. Электрофоретическое разделение может быть проведено в системах без неподвижных фаз (например, свободное разделение раствора в капилярном электрофорезе) и в стабилизированных средах, таких как тонкослойные пластинки, пленки или гели.

# Существует два различных метода электрофореза: фронтальный и зональный. Фронтальный электрофорез проводят в свободной незакрепленной среде, и он является единственным способом определения абсолютной электрофоретической подвижности. Зональный электрофорез проводят в закрепленной среде, роль которой состоит в стабилизации электрофоретических зон.

Капиллярный электрофорез основан на разделении заряженных компонентов сложной смеси в кварцевом капилляре под действием приложенного электрического поля за счёт подачи высокого напряжения к концам капилляра. Наиболее распространёнными вариантами метода КЭФ являются: капиллярный зонный электрофорез (КЗЭ) и мицеллярная электрокинетическая хроматография (МЭКХ).Этот метод обычно используется лишь для небольших образцов испытуемых веществ. Природа носителя, например, бумага, гель агара, ацетат целлюлозы, крахмал, агароза, полиакриламид, смешанный гель, служит причиной ряда дополнительных факторов, влияющих на подвижность: а) вследствие наличия каналов в фазе носителя, среднее растояние, которое проходит вещество, становится меньше реально пройденного расстояния; б) некоторые фазы носителя электрически не нейтральны. Следовательно, скорость передвижения зависит от таких главных факторов: подвижности заряженной частицы, потока скорости электроэндоосмоса и испарения жидкости с фазы носителя, а также силы (напряжения поля). Поэтому необходимо проводить испытание в строго определенных экспериментальных условиях и, по возможности, использовать стандартные вещества.

Прибор для электрофореза состоит из: источника постоянного тока, напряжение которого можно контролировать и, желательно, стабилизировать; электрофоретической камеры. Обычно это камера из стекла или твердой пластмассы, которая состоит из двух отдельных резервуаров – анодного и катодного, содержащих раствор электролита. В каждый резервуар камеры погружается электорд, напрмер, платиновый или графитовый. Они присоединяются изолированной схемой к соответствующему выходу источника питания и образуют анод и катод. Уровень жидкости в обоих резервуарах камеры поддерживается одинаковым для избежания переливания через сифон. Метод анализа - капиллярный электрофорез - на сегодняшний день является одним из наиболее перспективных и высокоэффективных методов разделения и анализа сложных смесей на составляющие компоненты и находит всё более широкое применение - и лекарственных средств. Метод характеризуется экспрессностью, микрообъемами анализируемого раствора, отсутствием колонки и твёрдого сорбента, проблем с его «старением» (в отличие от ВЭЖХ), физической и химической деструкции и любого неспецифического связывания с ним компонентов пробы, а также практически не требуется органических растворителей].

55. Масс-спектрометрия. Сочетание масс-спектрометрии с хроматографическими методами (ГХ-МС, ЖХ-МС). Применение в фармацевтическом анализе. Масс-спектрометрия основана на прямом измерении отношения массы к числу элементарных положительных или отрицательных зарядов ионов (m/z ), полученных из анализируемого вещества и находящихся в газовой фазе. Данное отношение выражается в атомных единицах массы (1 а.е.м. = одной двенадцатой массы нуклида 12С). Ионы, образовавшиеся в ионном источнике, ускоряются и перед попаданием в детектор разделяются с помощью масс-анализатора. Все эти действия происходят в камере, в которой насосная система поддерживает вакуум от 10 −3 до 10 −6 Па. Результирующий масс-спектр является графиком зависимости относительного количества различных ионов от отношения m/z. Сигнал, отвечающий иону, представлен несколькими пиками, соответствующими статистическому распределению различных изотопов этого иона. Такой сигнал называется изотопным профилем, а пик, представляющий наиболее распространённые изотопы для каждого атома, - моноизотопным пиком. Масс-спектрометрический анализ даёт важную качественную (определение молекулярных масс; информация, касающаяся структуры определяемых фрагментов) и количественную (с использованием внешнего или внутреннего стандартов) информацию с пределом обнаружения от пикомоля до фемтомоля. Газовая хроматография (ГХ) представляет собой метод разделения, в котором подвижной фазой является газ (газ-носитель), а неподвижной фазой, помещенной в колонку, является твердое вещество или жидкость, нанесенные на твердый инертный носитель или равномерно покрывающие внутренние стенки колонки. Газовая хроматография основана на механизмах адсорбции и/или распределения. Жидкостная хроматография(ЖХ) представляет собой метод разделения, в котором подвижной фазой является жидкость, а неподвижной фазой, помещенной в колонку, является тонкодисперсное твердое вещество или жидкость, нанесенная на твердый тонкодисперсный носитель, или химически модифицированный тонкодисперсный носитель посредством введения органических групп. Жидкостная хроматография основана на механизмах адсорбции, распределения, ионного обмена или разделения по размерам молекул. Газовая хроматография/масс-спектрометрия. При использовании подходящих колонок (капиллярных или полукапиллярных) возможно непосредственное введение конца колонки в ионный источник прибора без применения сепаратора. Жидкостная хроматография/масс-спектрометрия. Такая комбинация особенно полезна для анализа полярных соединений, которые являются недостаточно летучими либо слишком термолабильными, для того чтобы их можно было проанализировать методом газовой хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией. Данный метод осложняется трудностью получения ионов в газовой фазе из жидкой фазы, что требует применения специальных интерфейсов, таких как: