2.5.2. Визначення сечовини в сироватці крові
(за колірною реакцією з діацетилмонооксимом)
Принцип методу. Діацетилмонооксим у кислому середовищі гідролізується до діацетилу, який, реагуючи з сечовиною, утворює комплекс червоно-рожевого забарвлення, що має максимальне поглинання при довжині хвилі 520 нм.
Обладнання: КФК-2, КФК-3, водяна баня, гумові пробки, обгорнуті фольгою, пробірки, піпетки 0,2; 1 і 5 мл.
Реактиви: 1) кислий реагент – 0,06 %-ний розчин Н3РО4; 10 %-ний розчин H2SO4; 0,003 % -ний розчин FeCl3;
2) кольоровий реагент – 0,17 %-ний розчин діацетилмонооксиму (ДАМО) і 0,04%-ний розчин тіосемікарбазиду;
3) стандарт сечовини (16,65 ммоль/л), 1 г/л сечовини.
Використовують набір реактивів НВФ "Simko Ltd" (м. Львів).
Хід визначення. До 0,02 мл сироватки крові (сечі) додають 1 мл кольорового реагенту і 2 мл кислого реагенту. Пробірки щільно закривають гумовими пробками, які обгорнуті алюмінієвою фольгою, та інкубують точно 10 хв у киплячій водяній бані. Потім пробірки швидко охолоджують під струменем холодної води і не пізніше як через 10 хв визначають оптичну густину досліджуваних зразків та стандарту при довжині хвилі 490–540 нм (максимальне поглинання при 520 нм) проти контролю. Аналогічно обробляють 0,02 мл стандарту сечовини і контроль – 0,02 мл дистильованої води. Розрахунок проводять за формулою:
,
де Е дп – екстинція дослідної проби; Е ст – екстинція стандартного розчину; 16,65 – концентрація сечовини в стандартному розчині, ммоль /л.
Приклад. Поглинання дослідної проби – 0,350.
Поглинання стандарту (16,65 ммоль/л) – 0,640.
Концентрація сечовини в досліджуваній пробі буде становити:
ммоль/л.
При вмісті сечовини більше 25 ммоль/л пробу необхідно розбавити дистильованою водою і аналіз провести повторно, результат помножити на розведення.
Стабільність досліджуваних проб. Сечовина в дослідних пробах зберігається до 8 годин при кімнатній температурі, до 72 годин – при 2–8 °С, до 6 місяців – в замороженому стані.
Примітка. Об’єми досліджуваних проб і реагентів можна пропорційно змен-шувати чи збільшувати. Наприклад: до 0,01 мл проби (10 мкл) додають 0,5 мл кольорового реагенту і 1 мл кислого реагенту. Обробляють, як написано вище (див. хід визначення). Як альтернативний варіант перед проведенням дослідів можна змішати 1 об’єм кольорового реагенту з 2-ма об’ємами кислого реагенту і використовувати цю суміш для проведення аналізу (0,02 мл проби + 3 мл суміші або 0,01 мл проби + 1,5 мл суміші і т.д.).
2.5.3. Визначення сечовини у сироватці крові та сечі (за Марш)
Принцип методу. Сечовина утворює з діацетилмонооксимом у присутності тіосемікарбазиду і заліза в кислому середовищі комплексну сполуку, інтенсивність забарвлення якої пропорційна вмісту сечовини в сироватці крові або сечі.
Обладнання: КФК, водяна баня, центрифуга, гумові пробки, обгорнуті фольгою, піпетки 0,2; 1 і 5 мл, пробірки.
Реактиви: 1) 10 %-ний розчин трихлороцтової кислоти (ТХОК), ч;
2) 2,5 %-ний розчин діацетилмонооксиму, чда (готують змішуванням 0,25 г реактиву і 9,75 мл дистильованої води);
3) 0,25 %-ний розчин тіосемікарбазиду, чда, (0,25 г реактиву розчиняють у дистильованій воді і доводять водою до мітки 100 мл);
4) основний розчин заліза хлориду готують розчиненням 5 г заліза хлориду (хч, чда) в 100 мл дистильованої води, після чого додають 1 мл концентрованої сірчаної кислоти, хч;
5) робочий розчин заліза хлориду: 1 мл основного розчину заліза хлориду доводять до 100 мл дистильованою водою, додають 8 мл концентрованої сірчаної і 1 мл 85%-ного розчину ортофосфорної кислоти (хч, чда). Зберігають у темному місці до 2-х тижнів;
6) кольоровий реактив (до 30 мл робочого розчину заліза хлориду додають 20 мл дистильованої води, 1 мл 2,5 %-ного розчину діацетилмонооксиму і 0,25 мл розчину тіосемикарбазиду. Кольоровий реактив готують безпосередньо перед проведенням досліджень;
7) стандартний розчин сечовини (0,5 г еталону розчиняють в 1 л дистильованої води). Еквівалент концентрації – 8,33 ммоль/л.
Хід визначення. У центрифужну пробірку вносять 0,8 мл дистильованої води, 0,2 мл сироватки крові і 1 мл трихлороцтової кислоти, перемішують і через 10–20 хв центрифугують 15–20 хв при 3000 об/хв. У пробірку відбирають 0,5 мл надосадової рідини і додають 5 мл кольорового реактиву. Пробірку закривають пробкою, обгорнутою фольгою, витримують у киплячій водяній бані точно 20 хв і охолоджують 2–3 хв струменем води з крану. Не пізніше як через 15 хв вимірюють екстинцію проби на КФК при довжині хвилі 500–600 нм проти контролю у кюветі товщиною робочого шару 10 мм. Аналогічно обробляють 0,5 мл стандарту сечовини і контроль – 0,5 мл дистильованої води.
Розрахунок вмісту сечовини проводять за формулою:
Сечовина
(ммоль/л) =
8,33,
де Е дп – екстинція дослідної проби; Е ст – екстинція стандартного розчину;
8,33 – концентрація сечовини у стандартному розчині.
Для визначення сечовини у сечі її спочатку фільтрують, потім готують розведення 1:25 або 1:50, відбирають 0,2 мл суміші і визначають за вищеописаною методикою. Результат перемножують на ступінь розведення.
Діагностичне значення. У здорової великої рогатої худоби і свиней кількість ЗА в сироватці крові становить 15–29 ммоль/л. Підвищення вмісту залишкового азоту в крові називається гіперазотемією. Залежно від причин її поділяють на ретенційну і продуктивну. Ретен-ційна буває нирковою (при нефриті і пієлонефриті) і позанирковою, яка спостерігається внаслідок зменшення клубочкової фільтрації при хворобах серця та зневодненні.
Продуктивна гіперазотемія розвивається за рахунок азоту амінокислот внаслідок посиленого руйнування білків в організмі (злоякісні новоутворення).
Гіпоазотемія зустрічається значно рідше. Причиною її буває значне ураження печінки, внаслідок чого порушується синтез сечовини.
Уміст сечовини в сироватці крові молодняку великої рогатої худоби становить (ммоль/л) 3,0–6,5; корів – 3,5–6,0; свиней – 3,3–6,0; собак – 3,0–8,0; овець – 3,0–6,0; кіз – 4,0–7,0; лошат – 3,0–7,0; коней – 3,5–6,0; кішок – 3,3–11,0. Концентрація сечовини залежить від інтенсивності її синтезу та виведення, тому визначення її є важливим діагностичним тестом як функції печінки, де синтезується сечовина, так і нирок, через які вона виводиться. Частіше зустрічається підвищення вмісту сечовини, що свідчить про ураження нирок. При гострій нирковій недостатності рівень сечовини в сироватці крові зростає до 50–80 ммоль/л і навіть більше, а виділення її з сечею різко зменшується. Якщо вміст сечовини сягає 35 ммоль/л, то це вказує на середній ступінь ураження нирок. При хронічному перебігу гломерулонефриту та в азотемічній стадії нефротичного синдрому вміст сечовини підвищується до 13–15 ммоль/л, а в термінальній стадії хронічної ниркової недостатності – до 30–35 ммоль/л. Кількість азоту сечовини у фракції ЗА збільшується до 90 %.
Зниження вмісту сечовини в сироватці крові спостерігається при аліментарному виснаженні, тяжкому перебігу патології печінки. Оскіль-ки вміст ЗА може залишатися в межах норми, то процентне відношення азоту сечовини до ЗА стає менше 45 %, якщо перерахунок робити в мг/100 мл, або 10 % – при розрахунку в ммоль/л. Якщо на фоні підвищення вмісту ЗА кількість сечовини починає зменшуватися, то має місце комбінована патологія нирок і печінки (гепатореналь-ний синдром).