2.4.7. Тимолова проба

Принцип методу. Бета- і гамма-глобуліни та ліпопротеїни сироватки крові осаджуються тимоловим реактивом при рН 7,55. Залежно від концент-рації і співвідношення окремих білкових фракцій під час реакції виникає помутніння розчину, інтенсивність якого визначають турбідиметрично.

Обладнання: фотоелектроколориметр (кфк-2, КФК-3) або спек-трофотометр; пробірки; піпетки на 1, 5 і 10 мл.

Реактиви: 1) концентрований розчин тимолу (тимол 6,66 ммоль/л у буфері) – 8,5 мл;

2) калібрувальний розчин І (сірчана кислота – 2,5 моль/л, хч, чда) – 11 мл;

3) калібрувальний розчин ІІ (барію хлорид – 48 ммоль/л, хч) – 5 мл.

Використовують набір реактивів НВФ "Simko Ltd" (м. Львів).

Приготування тимолового реактиву. У мірну колбу на 1 л наливають 900 мл дистильованої води і при постійному перемішуванні на магнітній мішалці поступово додають піпеткою 15 мл реактиву 1. Кінчик піпетки обов’язково повинен бути опущений у воду. Розчин доливають дистильованою водою до мітки і перемішують 10 хв. Тимоловий реактив зберігають при кімнатній температурі. Розчин стабільний декілька місяців.

Приготування контрольного розчину І. У мірну колбу на 250 мл піпеткою відмірюють 10 мл реактиву 2, доливають до мітки дистильованою водою, охолодженою до +8°С, і перемішують.

Приготування контрольного розчину ІІ. У мірну колбу на 50 мл піпеткою відмірюють 1,5 мл реактиву 3, доливають до мітки контрольним розчином І, охолодженим точно до +10°С. Вміст колби ретельно перемішують.

Похибка методу: ± 8 %.

Хід визначення. Визначення проводять на фотоелектроколориметрі або на спектрофотометрі (довжина хвилі 620–660 нм) у кюветі з товщиною оптичного шару 10 мм згідно зі схемою, наведеною у табл. 9.

Таблиця 9 – Схема проведення тимолової проби

Речовина	Дослідна проба	Контрольний розчин І	Контрольний розчин ІІ
Сироватка крові	0,05	–	0,05
Тимоловий реактив	3,00	3,00	–
0,85 %-ний розчин NaCl	–	0,05	3,00
Після внесення реактивів пробірки витримати 30 хв при кімнатній температурі. Знову перемішати і виміряти оптичну густину дослідної проби (А), проти контрольного розчину І. Якщо сироватка крові мутна, то вимірюють проти контрольного розчину ІІ.

Калібрування. Шляхом розведення контрольних розчинів І і ІІ готують шкалу розведених стандартів відповідних одиниць (5–20) за Shank-Hoagland (од. S-H) (табл. 10).

Таблиця 10 – Схема побудови калібрувального графіка

№ розчину	Контрольний розчин І	Контрольний розчин ІІ	Одиниці помутніння S-H
1 2 3 4	4,5 3,0 1,5 –	1,5 3,0 4,5 6,0	5 10 15 20
У пробірках змішують контрольний розчин І із контрольним розчином ІІ і точно через 30 хв вміст пробірок ретельно перемішують. Після чого вимірюють оптичну густину проти дистильованої води. Довжина хвилі 620–660 нм.

Діагностичне значення. У клінічно здорових тварин (великої і дрібної рогатої худоби, коней і собак) значення проби становлять 0–3 од. помутніння (од. S-H). Збільшення помутніння понад 3,0 од. S–H свідчить про ураження паренхіми печінки ("синдром запалення"), яке частіше виявляють у коней і собак (рідше у полігастричних тварин) при токсичних та інфекційних гепатитах, цирозі печінки.

Пробу можна використовувати для диференціальної діагностики механічної і паренхіматозної жовтяниць. Так, при механічній жовтяниці значення од. S-H не перевищують верхньої межі норми, а проба стає позитив-ною при ускладненні патологічного процесу паренхіматозним гепатитом.

Тимолова проба є неспецифічною для печінки, її показники зростають при всіх захворюваннях, що супроводжуються диспротеїнемією.

Примітка. Якщо помутніння перевищує 20 од. S-H, аналіз повторюють, попередньо розвівши пробу ізотонічним розчином NaCl (1:1). Результат необхідно помножити на 2.