4. Дослідження обміну вуглеводів
Вуглеводи – основні складові живлення сільськогосподарських тварин і найважливіше джерело енергії. Вуглеводи поділяються на прості (моносахариди) і складні. Серед останніх, у свою чергу, виділяють три групи: олігосахариди, гомополісахариди (глікани) і гетерополісахариди (кислі і нейтральні). Молекули моносахаридів мають один вуглецевий лан-цюг, і всі вони не піддаються гідролізу. Залежно від кількості атомів вуглецю, що входять до складу молекули моносахаридів, їх поділяють на тріози, тетрози, пентози, гексози та ін. Найбільш поширеними серед моносахаридів є тріози (С3Н6О3; гліцероловий альдегід, діоксіацетон), пентози (С5Н10О5; рибоза, дезоксирибоза, рибулоза) і гексози (С6Н12О6; глюкоза, фруктоза, галактоза, маноза та ін.). У моногастричних тварин вуглеводи кормів у кишечнику розкладаються до моноцукрів (глюкози, фруктози та галактози). Фруктоза і галактоза у стінці тонкого кишечнику перетворюються у глюкозу, яка всмоктується в кров, надходить до тканин, а надлишок її відкладається у печінці та м’язах у вигляді глікогену.
У жуйних більша частина вуглеводів у передшлунках ферментується до летких жирних кислот (ЛЖК) – оцтової, пропіонової та масляної. З пропіонової кислоти у печінці і частково у стінці травного каналу синтезується глюкоза (глюконеогенез). Лише 10 % глюкози кормів всмоктується в тонкому кишечнику.
Одним із показників обміну вуглеводів є вміст глюкози в сироватці крові, який визначається кількома методами: ферментативним (глюкозооксидазним), орто-толуїдиновим, за методом Сомоджі, Хагедорна-Ієнсена, Борисова (з пікриновою кислотою). Проте останні три методи дають завищені показники, оскільки разом з глюкозою визначаються й інші цукри. Глюкозу визначають у крові, сироватці та плазмі. Вміст глюкози в крові і плазмі майже однаковий, проте швидко знижується внаслідок гліколізу. Тому визначають її не пізніше 2 год після взяття крові, або швидко осаджують білки трихлороцтовою кислотою.
4.1. Визначення глюкози за колірною реакцією з орто-толуїдином
Принцип методу. Глюкоза при нагріванні з орто-толуїдином у розчині оцтової кислоти утворює сполуку, інтенсивність зафарбування якої є пропорційною концентрації глюкози.
Обладнання: КФК-2, КФК-3 або спектрофотометр, центрифуга, водяна баня, піпетки 0,2; 0,5; 2 мл, пробірки, гумові пробки, обгорнуті фольгою.
Реактиви: 1) 3 %-ний розчин трихлороцтової кислоти (ТХОК), чда;
2) орто-толуїдиновий реактив, чда: у 94 мл льодяної оцтової кислоти розчиняють 0,15 г тіосечовини і додають 6 мл орто-толуїдину. Реактив – стійкий при зберіганні в холодильнику;
3) стандартний 500 мг%-ний розчин глюкози, приготовлений у 0,2 %-ному розчині бензойної кислоти.
Використовують набір реактивів НВП "Реагент" (м. Дніпропетровськ).
Хід визначення. У пробірку вносять 1,8 мл 3 %-ного розчину ТХОК і додають 0,2 мл свіжої або стабілізованої натрію фторидом крові. Центрифугують 15 хв при 1500 об/хв. До 0,5 мл центрифугату додають 4,5 мл орто-толуїдинового реактиву. Пробірки закривають гумовими пробками, обгорнутими фольгою, і ставлять у киплячу водяну баню (вода має безперервно кипіти) точно на 8 хв, після чого їх одразу ж охолоджують під проточною водою. Оптичну густину вимірюють на фотоелектроколориметрі (ФЕК-56М, КФК-2, КФК-3) при довжині хвилі 590–650 нм (оранжевий або червоний світлофільтр) у кюветі з товщиною робочого шару 10 мм. Контроль: 0,5 мл ТХОК + 4,5 мл орто-толуїдинового реактиву.
Стандартна проба ставиться так само, як і дослідна, але замість крові беруть стандартний розчин глюкози з концентрацією 50– 100 мг/100 мл, тобто стандартний розчин розбавляють у 10 чи в 5 разів. Розрахунок проводять за формулою:
де С – концентрація глюкози у пробі, мг/100 мл крові;
С ст – концентрація глюкози у стандарті;
Е д – оптична густина дослідної проби; Е ст – оптична густина стандарту.
Примітка. Для перерахунку вмісту глюкози з мг/100 мл у ммоль/л необхідно одержаний результат перемножити на 0,0555 або поділити на 18.