4.2. Визначення глюкози у плазмі крові глюкозо-оксидазним методом

Принцип методу. Глюкоза у присутності глюкозо-оксидази окис-нюється киснем повітря до глюконової кислоти та перекису водню. Останній за наявності пероксидази вступає в реакцію з фенолом і 4-амінофеназоном з утворенням хіноніміну червоно-фіолетового кольору, інтенсивність якого визначається фотометрично.

Обладнання: КФК-2, КФК-3 або спектрофотометр, центрифуга, водяна баня, піпетки 0,2; 0,5; 2 мл, пробірки.

Реактиви: 1) розчин ферментів (пероксидаза), ч, хч;

2) фосфатний буферний розчин (рН 7,4), чда;

3) антикоагулянт (суха суміш 0,536 г натрію щавлевокислого і 3,4 г натрію хлориду), чда;

4) калібрувальний розчин (вміст глюкози – 10,0 ммоль/л), чда.

Використовують набір реактивів НВП “Реагент”(м. Дніпропетровськ).

Приготування робочого розчину. У колбу ємністю 200 мл перенести вміст флакона з буферним розчином, додати 100–120 мл дистильованої води, розчин ферментів і довести до мітки дистильованою водою.

Приготування розчину антикоагулянта. У колбу ємністю 500 мл внести суміш антикоагулянта і додати 400 мл дистильованої води, перемішати до повного розчинення кристалів солей. За необхідності розчин фільтрують.

Хід визначення. Для отримання плазми 0,1 мл крові змішують з 0,9 мл розчину антикоагулянта і центрифугують 10 хв при 2000 об/хв.

Визначення глюкози проводять на фотоелектроколориметрі (довжина хвилі 500–546 нм) або на спектрофотометрі (500 нм) у кюветі з товщиною оптичного шару 10 або 5 мм за схемою, поданою у табл. 12. Якщо вміст глюкози у плазмі крові більше 27,7 ммоль/л, її потрібно розвести ізотонічним розчином у 5 разів і повторити визначення.

Таблиця 12 – Схема визначення глюкози у плазмі крові

Речовина	Калібрувальна проба	Дослідна проба	Контрольна проба
Калібрувальний розчин	0,02	–	–
Плазма крові	–	0,2	–
0,85 %-ний розчин NaCl	0,2	–	0,2
Робочий розчин	2,0	2,0	2,0
Усе змішати, витримати 20 хв при кімнатній температурі (18–25 °С) або 12 хв у термостаті (37°С). Виміряти поглинання дослідної проби (А), калібрувального розчину (В) проти контрольної проби.

Розрахунок умісту глюкози у плазмі крові проводять за формулою:

де С – концентрація глюкози, ммоль/л; 10 – стабільна величина; А – поглинання дослідної проби; В – поглинання калібрувального розчину; К – коефіцієнт розведення плазми крові.

Діагностичне значення. Вміст глюкози в крові є відносно постійною величиною і залежить від виду та віку тварин (табл. 13).

Таблиця 13 – Уміст глюкози в крові здорових тварин

Вид тварин	Глюкоза
	мг/100мл	ммоль/л
Велика рогата худоба: дорослі тварини телята віком 2–5 днів 9–12-денні Вівці Свині Коні Собаки Кролі Кури Норки Песці	45–60 80–85 75–80 45–60 50–70 55–90 60–80 75–95 80–140 100–190 100–150	2,5–3,3 4,4–4,7 4,2–4,5 2,5–3,3 2,75–3,9 3,0–5,0 3,3–4,5 4,2–5,3 4,5–7,8 5,5–10,5 5,5–8,3

Порушення вуглеводного обміну супроводжується зниженням рівня глюкози в крові (гіпоглікемія) або її підвищенням (гіперглікемія).

Гіпоглікемія спостерігається при недостатньому вмісті у кормах легкотравних вуглеводів (цукру і крохмалю), виснаженні легкомобілізованих запасів цукру при транспортному стресі, підвищеній витраті цукру на терморегуляцію, особливо в поросят у перші дні життя (гіпоглікемія поросят), у фазі інтенсивної лактації, при тяжкому фізич-ному навантаженні. Окрім того, гіпоглікемію виявляють при аліментарній дистрофії, коли вміст глюкози менший 1 ммоль/л, кетозі (вміст глюкози зменшується одночасно зі зростанням кетонемії), за дефіциту панкреатичної амілази внаслідок панкреатиту та при хронічному ентериті, коли порушуються процеси розпаду вуглеводів та їх всмоктування. Гіпоглікемію часто реєструють при патології печінки, зокрема жировій гепатодистрофії у корів. Вона розвивається внаслідок передозування інсуліну, особливо на фоні низького рівня глюкози в крові (гіпоглікемічна кома), при захворюваннях підшлункової залози, які супроводжуються дефіцитом глюкагону та підвищеним продукуванням інсуліну (наприклад, при інсуліномі – пухлині, що розвивається з -клітин острівців Лангерганса, вміст глюкози у хворих німець-ких вівчарок зменшується до 2,8 ммоль/л).

Збільшення концентрації глюкози (гіперглікемія) буває аліментарного, симпатичного та діабетичного походження. Аліментарна гіперглікемія виникає після згодовування тваринам, особливо моногастричним, великої кількості цукристих кормів. Симпатична гіперглікемія є наслідком підвищеного розпаду глікогену (глікогенолізу) – при стресах, підвищеній збудливості кори головного мозку (сказ, хвороба Ауєскі) та гіперфункції надниркових залоз. Посилене продукування адреналіну активує фосфорилазу печінки та м’язів, інгібує синтез глікогену, а збільшення синтезу глюкокортикоїдів стимулює глюконеогенез, тобто посилює утворення глюкози з невуглеводних джерел.

Діабетична гіперглікемія розвивається при недостатній секреції інсуліну (цукровий діабет). У генезі цукрового діабету важливим є порушення процесів внутрішньоклітинного засвоєння глюкози, внаслідок порушення транспорту її через клітинну мембрану. Глюкоза нагромаджується у крові та в міжклітинній рідині, спричинюючи ефект дегідратації клітин, оскільки вода з клітин починає надходити в навколишню рідину, яка має вищий осмотичний тиск. Таким чином, на фоні гіперглікемії тканини відчувають дефіцит глюкози і, внаслідок цього, – нестачу енергії. Нестача інсуліну та дефіцит енергії зумовлюють посилення процесів розщеплення жирів (ліполізу) і глюконеогенезу. Проте, повне розщеплення жирів до кінцевих продуктів не відбувається через дефіцит енергії, тому в організмі нагромаджуються проміжні продукти розпаду жирних кислот – кетонові тіла. Гіперглікемія спричинює розвиток глюкозурії.