9.8. Визначення заліза

В організмі дорослих тварин концентрація заліза в середньому становить 0,005–0,006 % у розрахунку на свіжу тканину. У тілі корови масою 600 кг міститься близько 36 г заліза, у свині масою 100 кг – 5 г, курки масою 2 кг – 0,16 г. Майже все залізо у тілі тварин знаходиться у формі органічних сполук. Зокрема, воно входить до складу більш як 70 різних за своєю функцією ферментів. Ці сполуки ділять на дві групи: а) ті, які містять залізо в геміновій формі (порфіринові) – гемоглобін, міоглобін, цитохроми, цитохромоксидаза, каталаза, пероксидаза (70–75 % всієї кількості заліза; б) негемінове залізо – трансферин, феритин, гемосидерин (20–25 %).

9.8.1. Визначення заліза в сироватці крові

(за реакцією з бета-фенантроліном)

Принцип методу. Бетофенантролін утворює з іонами двовалент-ного заліза комплекс червоного кольору, інтенсивність якого визначають фотометрично при довжині хвилі 510–550 нм.

Обладнання: КФК-2, КФК-3 або спектрофотометр, центрифуга, мірні колби на 100 мл, піпетки на 1; 5 мл, пробірки.

Реактиви: 1) стандартний розчин амонію заліза (ІІ) сірчанокислого 17,9 мкмоль/л – 40 мл;

2) бета-фенантролін – 2 х 55 мл;

3) концентрована тіогліколева кислота – 4 мл;

4) розчин для осадження білків – 2 х 55 мл.

Використовують набір реактивів "Біо-Тест, Lachema (Чехія).

Приготування робочих розчинів. Р о з ч и н д л я о с а д ж е н н я б і л к і в. У мірну колбу на 100 мл відміряють 3 мл реактиву 3 і доливають до мітки реактивом 4. Якщо розчин помутніє, його фільтрують через щільний фільтр. Розчин стійкий протягом 2-х місяців зберігання в темному і прохолодному місці.

Хід визначення. До 1 мл сироватки крові додають 1 мл розчину для осадження білків. Суміш перемішують. Одночасно готують калібрувальну пробу (0,5 мл стандартного розчину + 0,5 мл розчину для осадження білків).

Через 5 хв пробу центрифугують протягом 10 хв при 3000 об/хв. У чисту пробірку відбирають 1 мл надосадової рідини. В усі пробірки (надосадова рідина, стандарт, контроль) додають по 1 мл реактиву 2. Протягом 50–60 хв вимірюють оптичну густину проби (А₁) і стандарту (А₂) проти контрольного розчину при довжині хвилі 510–550 нм на спектрофотометрі або КФК-3 в 10 мм кюветі.

Вміст заліза у сироватці крові визначають за формулою:

Fe, мкмоль/л =

де А₁ – оптична густина дослідного зразка, А₂ – оптична густина стандарту.

Примітки. 1. При визначенні заліза необхідно використовувати лабораторний посуд, призначений виключно для цієї мети.

2. Сироватка крові зі слідами гемолізу завищує показник і є необ’єктивною щодо вмісту сироваткового заліза.

9.8.2. Визначення заліза методом атомно-абсорбційної спектрофотометрії

Приготування зразків. Для визначення заліза сироватку крові розводять у 5 разів бідистильованою водою або, після осадження білків, трихлороцтовою кислотою. Пряме визначення дає завищені результати через частковий гемоліз. Загальноприйнятою вважається методика з осадженням білків: 2 мл сироватки вносять у центрифужну пробірку, додають 1 мл 1,2 М HCl і розчин залишають в термостаті при 38 С на 1 год. Після цього додають 1 мл 20 %-ного розчину CCl₃COOH, розмішують, витримують 1 год при кімнатній температурі і центрифугують. У фільтраті визначають Fe, за необхідності Cu i Zn, а також інші мікроелементи.

Калібрувальний розчин. Розчини з концентрацією Fe 0,5; 1 і 2 мкг/мл готують на тих же рідинах, що і зразки.

Методика вимірювання. Атомно-абсорбційний спектрофотометр (С-115-М1, AAS-30) готують до роботи згідно з настановою щодо експлуатації приладу.

Розпилення калібрувальних розчинів та зразків проводять в окиснювальному полум’ї ацетилен-повітря.

Аналітична довжина хвилі – 248,3 нм; відносна чутливість – 1; ширина щілини – 0,1 нм; сила струму лампи – 5 мА; нижня межа визначення – 0,01 мг/л; діапазон оптимальних концентрацій – 1,0–10,0 мг/л.

Діагностичне значення. Фізіологічні величини вмісту заліза в сироват-ці крові тварин наведено в додатку Д. Абсорбція заліза залежить від віку, забезпеченості організму залізом, стану шлунка і кишечнику, хімічної форми, в якій надходить залізо, та компонентів корму. У тварин з однокамерним шлунком комплексні сполуки заліза під впливом соляної кислоти і пепсину розщеплюються і тривалентне залізо, відновлюючись, переходить у двовалентне. Всмоктування заліза відбувається, головним чином, у дванадцятипалій і порожній кишках. У деяких сполуках добре всмоктується також тривалентне залізо. Для оптимального всмоктування заліза необхідна нормальна секреція шлункового соку. Сприяють засвоєнню заліза білок тваринного походження (очевидно, внаслідок утворення комплексів з амінокислотами), аскорбінова кислота, токоферол, прості вуглеводи (лактоза, фруктоза), сорбіт, амінокислоти (цистеїн, лізин, гістидин). Пригнічують всмоктування заліза білки сої і фосфати.

Впливають на засвоєння заліза різні захворювання. Стимулюється засвоєння заліза при його нестачі, різних анеміях, В₆-гіповітамінозі, що пояснюється посиленням гемоцитопоезу. Зменшується засвоєння заліза при гіпоацидних і анацидних гастритах, діареях різної етіології внаслідок швидкого транзиту хімусу.

У дорослих тварин із кормів засвоюється 5–10 % заліза, а при інтенсивному еритроцитопоезі – 15–20 %. У телят засвоюється 15–25 % заліза молока.

Близько 70 % заліза плазми крові потрапляє в кістковий мозок. За рахунок розпаду гемоглобіну в людей за добу звільняється 21–24 мг заліза, з кишечнику абсорбується 1–2 мг. З організму залізо виділяється, в основному, при злущуванні епітелію слизової оболонки кишечнику і з жовчю. Усього за добу в людини виділяється 0,6–1 мг заліза і така ж кількість засвоюється.

Дефіцит заліза (гіпосидероз) є одним із найбільш поширених мікроелементозів у молодняку сільськогосподарських тварин, особливо в поросят і телят. Поросята-сисуни починають хворіти з 5–7-денного віку, максимального розвитку хвороба досягає у тритижневому віці. Телята хворіють від дня народження до 2–3-місячного віку, але симптоми хвороби у них менше виражені, порівняно з поросятами. Захворювання реєструють у 30–40 % телят. Основною причиною анемії поросят є нестача заліза, тому її називають залізодефіцитною, оскільки запаси його в органах і тканинах невеликі (близько 50 мг), а з молозивом чи молоком матері вони одержують 1 мг при добовій потребі 7–10 мг. До тритижневого віку поросятам потрібно від 114 до 200 мг заліза, з молоком вони одержують 23–24 мг.

Запаси заліза в телят, нагромаджені у внутрішньоутробний період, швидко витрачаються після народження, оскільки добова потреба телят становить 50–100 мг заліза, а в перші чотири тижні життя вона задоволь-няється лише на 10 %. Тому вміст заліза і міді в крові стає низьким у 20–30-денному віці. У цей же період у більшості телят вміст гемоглобіну досить низький – у межах від 50 до 70 г/л.

Гіпосидероз надзвичайно поширений серед людей. За даними ВООЗ (1977), більше половини дітей хворіють на анемію, і переважно – на залізодефіцитну. Не менше 18 млн жителів США страждають гіпосидерозом (Авцын А.П. с соавт., 1991). Медики вважають, що гіпохромна анемія є пізньою стадією гіпосидерозу, оскільки окремі ознаки хвороби є неспецифічними (легка втома, головний біль, депресія, тахікардія, поверх-неве дихання, запаморочення, анорексія, спотворення смаку).