7.2. Визначення білірубіну за методом Ієндрашика, Клеггорна і Грофа

Обладнання: фотоелектроколориметр (КФК-2, КФК-3), водяна баня, мірні колби, піпетки на 1; 2 мл, пробірки.

Реактиви: 1) реагент 1 – 15 мг NaNO₂, хч;

2) реагент 2 – 60 мл 0,5 % -ної сульфанілової кислоти;

3) буферний розчин 1 (кофеїновий реактив) – 150 мл;

4) буферний розчин 2–10 мл.

Використовують набір реактивів НВФ “Simko Ltd”( м. Львів).

Приготування буферного розчину для визначення загального білірубіну (кофеїновий реактив). Вміст флакона з буферним розчином 1 у мірному посуді доводять дистильованою водою до кінцевого об’єму 200 мл, перемішують. Розчин зберігають у посуді з темного скла.

Приготування буферного розчину для визначення кон’югованого (прямого) білірубіну. Вміст флакона з буферним розчином 2 переносять у мірний посуд і доводять дистильованою водою до кінцевого об’єму 220 мл.

Приготування діазореактиву. Безпосередньо перед визначенням змішують 10 частин реагенту 3 і 0,3 частини реагенту 2 (за об’ємом). Розчин готують перед використанням.

Хід визначення. У 4 пробірки (для визначення загального і кон’югованого білірубіну, а також – контрольні) додають реагенти відповідно до схеми (табл. 22).

Таблиця 22 – Схема визначення білірубіну

Розчин, мл	Контроль для загального білірубіну	загальний білірубін	контроль для кон’югованого білірубіну	Кон’югований білірубін
Сироватка крові	0,50	0,50	0,50	0,50
Кофеїновий реактив	1,75	1,75	1,75	–
Буферний розчин (кон’югований білірубін)	–	–	0,25	1,75
Діазобарвник	–	0,25	–	0,25
0,85 %-ний розчин NaCl	0,25	–	–	–

Для визначення кон’югованого (прямого) білірубіну оптичну густину проби вимірюють через 5–10 хв (при довготривалому стоянні в реакцію вступає непрямий білірубін), а загального – через 20 хв. Вміст некон’югованого білірубіну визначають як різницю між рівнями загального і кон’югованого білірубіну. Контроль на мутність сироватки ставлять для кожної проби.

Оптичну густину проб визначають за калібрувальним графіком, який готують попередньо, використовуючи білірубін-стандарти.

Фізіологічні величини вмісту білірубіну в сироватці крові тварин наведені в таблиці 23.

Збільшення кількості білірубіну в сироватці крові – гіпербілірубінемія – спостерігається при захворюваннях, які супроводжуються гемолізом еритроцитів за рахунок збільшення в крові некон’югованого (непрямого, вільного, не проведеного через печінку) білірубіну (піроплазмідози, лептоспіроз, отруєння речовинами, що спричинюють гемоліз еритроцитів).

Таблиця 23 – Кількість білірубіну в сироватці крові тварин

Вид тварин	Загальний білірубін		Кон’югований білірубін
	мг/100 мл	мкмоль/л	мг/100 мл	мкмоль/л
Корови	0,1–0,6	1,71–10,3	–	–
Телята	0,22–0,30	3,7–5,1	–	–
Вівці	0–0,4	0–6,84	0–0,1	0–1,71
Коні	0,23–0,85	4–14,5	0,03–0,2	0,5–3,5
Лошата	0,47–0,93	8,0–16,0	0,12–0,20	2,0–3,4
Свині	0–0,4	0–6,84	–	–
Кури	0,1–0,35	1,71–6,0	–	–
Собаки	0,02–0,23	0,4–4,5	–	–

Збільшення вмісту кон’югованого білірубіну спостерігається у тварин при механічній жовтяниці, а одночасне підвищення вмісту обох фракцій пігменту – при паренхіматозній жовтяниці, зумовленій гепатитом або гепатодистрофією.