2.2.1. Визначення білкових фракцій сироватки крові

нефелометричним (турбідиметричним) методом

Принцип методу. Різні білкові фракції сироватки крові осаджуються фосфатними розчинами певної концентрації.

Обладнання: фотоелектроколориметр (КФК-2, КФК-3); хімічні пробірки; піпетки на 1, 2, 5 мл; мірні колби на 500 і 100 мл.

Реактиви: 1) натрію гідроокис (NaOH), хч, чда;

2) калій фосфорнокислий однозаміщений (KH₂PO₄), хч, чда.

Приготування розчинів. 1. Основний фосфатний розчин: у 400 мл дистильованої води (мірна колба на 500 мл) розчиняють 33,5 г натрію гідроокису (NaOH). Після охолодження до кімнатної температури в колбу вносять 226,8 г калію фосфорнокислого однозаміщеного (KH₂PO₄), перемішують до повного його розчинення і доводять дистильованою водою до об’єму 500 мл.

2. Робочі фосфатні розчини готують із основного – в мірні колби на 100 мл відбирають основного розчину: 92,4 мл (№ 1), 74,9 (№ 2), 58,8 (№ 3), 48,7 мл (№ 4) і доводять дистильованою водою до мітки.

Хід визначення. На кожну пробу сироватки крові у штатив ставлять 6 пробірок, які позначають цифрами 0, 1, 2, 3, 4 і 5. У пробірку № 0 вносять 5 мл дистильованої води, в пробірки № 1, 2, 3, 4 – по 5 мл відповідних робочих фосфатних розчинів, а у пробірку № 5 – 0,5 мл сироватки крові, 0,75 мл дистильованої води та 3,75 мл основного фосфатного розчину (табл. 5). Пробірку № 5 закривають пробкою і перемішують, перевертаючи 5–6 разів. У подальшому з цієї пробірки переносять по 0,5 мл суміші у пробірки № 4, 3, 2, 1 і 0.

Таблиця 5 – Основні етапи виконання роботи

Реактиви, мл	Пробірки
	0	1	2	3	4	5
Робочі розчини: № 1 № 2 № 3 № 4	–	5	–	–	–	–
	–	–	5	–	–	–
	–	–	–	5	–	–
	–	–	–	–	5	–
Сироватка крові	–	–	–	–	–	0,5
Дистильована вода	5	–	–	–	–	0,75
Основний фосфатний розчин	–	–	–	–	–	3,75

Вміст пробірок ретельно, але обережно перемішують, не допускаючи утворення піни або бульбашок повітря. Через 15 хвилин визначають оптичну густину (Е) вмісту пробірок на фотоелектроколориметрі при довжині хвилі 590 нм в кюветі товщиною шару 10 мм у зворотній послідовності проти контролю: спочатку в пробірці № 4, а потім у пробірках № 3, 2 і 1 проти контрольного розчину (пробірка № 0).

Розрахунок проводять за схемою:

1. Е пробірки № 1 – Е пробірки № 2 = Е альбумінів;

2. Е пробірки № 2 – Е пробірки № 3 = Е альфа-глобулінів;

3. Е пробірки № 3 – Е пробірки № 4 = Е бета-глобулінів;

4. Е пробірки № 4 = Е гамма-глобулінів.

Приймаючи суму Е альбумінів і Е всіх глобулінових фракцій за 100 %, вираховують вміст кожної фракції крові у відносних величинах (процентах). Знаючи концентрацію загального білка в сироватці крові, можна провести перерахунок білкових фракцій в абсолютні величини (г/л).

Наприклад: Е пробірки 1 = 0,800; Е пробірки 2 = 0,400; Е пробірки 3 = 0,300; Е пробірки 4 = 0,200. Тоді Е альбумінів дорівнює 0,800 – 0,400 = 0,400; Е альфа-глобулінів дорівнює 0,400 – 0,300 = 0,100; Е бета-глобулінів дорівнює 0,300 – 0,200 = 0,100; Е гамма-глобулінів = = 0,200. Сума оптичної густини (Е) становить: 0,400 + 0,100 + 0,100 + + 0,200 = 0,800. Відносний вміст альбумінів становить: 0,800 – 100 %; 0,400 – х %; х = 50 %; альфа-глобулінів – 0,100  0,100 : 0,800 = 12,5 %; бета-глобулінів – 0,100  0,100 : 0,800 = 12,5 %; гамма-глобулінів – 0,200  0,100 : 0,800 = 25 %.

Похибка методу ± 4 %.