7.3. Визначення кількості гемоглобіну в крові геміглобінціанідним методом

(за Піменовою Л.М. та Дервізом Г. В.)

Гемоглобін – це дихальний фермент крові, який міститься в еритроцитах і забезпечує транспорт кисню з легень до тканин та вуглекислоти з тканин до легень, входить до складу гемоглобінової буферної системи крові, яка бере участь у регуляції кислотно-основного балансу. Синтезується гемоглобін у червоному кістковому мозку, а руйнується через 110–130 днів життя еритроцитів у клітинах фагоцитувальних мононуклеарів.

Існують фізіологічні й патологічні типи гемоглобіну. До фізіо-логічних відносять гемоглобін А (гемоглобін дорослих) з його трьома видами (Нb А₁, Нb А₂ i Нb А₃) та гемоглобін фетальний (Нb F), який становить основну кількість гемоглобіну плода. Патологічні види гемоглобіну (В, С, D, Е та ін.) виникають у результаті уродженого дефекту синтезу гемоглобіну, вони передаються потомству і є основою розвитку гемоглобінопатій (гемоглобінозів), які можуть бути причиною анемій гемолітичного типу.

Гемоглобін може вступати в сполуки не лише з киснем (оксигемоглобін) та вуглекислотою (карбогемоглобін), але й з іншими газами та речовинами. При сполученні з окисом вуглецю (СО) утворюється карбоксигемоглобін, з нітритами (нітритотоксикоз) – метгемоглобін, а при сполученні з сульфаніламідами – сульфогемоглобін, який також не може транспортувати кисень.

Принцип методу. Гемоглобін при взаємодії з калієм залізосинєродистим і ацетонціангідрином окиснюється в кольоровий геміглобін-ціанід, інтенсивність забарвлення якого пропорційна концентрації гемоглобіну.

Обладнання: КФК-2, КФК-3, пробірки, піпетки мірні на 0,02 мл і 5 мл, колби мірні.

Реактиви: 1) реагент 1 – 5 %-ний розчин NaHCO₃, хч; – 100 мл;

2) реагент 2 – 1 %-ний розчин К₃[Fe (CN)₆], (хч), що містить 2,5 %-ний розчин ацетонціангідрину, чда; – 100 мл;

3) стандартний розчин гемоглобіну – 25 мл.

Використовують набір реактивів НВФ “Simko Ltd”( м. Львів).

Приготування робочого розчину (реактиву Драбкіна): до 1 об’єму реагента 1 додають 1 об’єм реагента 2 і 48 об’ємів дистильованої води. Суміш перемішують і зберігають у колбі з темного скла.

Хід визначення. До 5 мл робочого розчину в пробірку додають 0,02 мл крові і перемішують. Аналогічно готують стандартну пробу. Через 10–15 хв на фотоелектороколориметрі (КФК-2, КФК-3) при довжині хвилі 540 нм (зелений світлофільтр) у кюветі з товщиною робочого шару 10 мм визначають оптичну густину дослідної проби і стандарту проти контрольного розчину (робочий розчин або дистильована вода. За формулою чи калібрувальним графіком визначають уміст гемоглобіну в крові (г/100 мл або г/л):

Гемоглобін (г/100 мл) = (Е досл. : Е ст.)  59,75  251 х 0,001,

де Е досл. – оптична густина дослідної проби; Е ст. – оптична густина стандарту; 59,75 – концентрація геміглобінціаніду в стандартному розчині; 251 – розведення крові, 0,001 – коефіцієнт для перерахунку в г/100 мл.

Для побудови калібрувального графіка готують ряд розведень з різним умістом гемоглобіну (табл. 24).

Таблиця 24 – Розведення гемоглобіну для побудови калібрувального графіка

№ п/п	Стандартний розчин, мл	Робочий розчин, мл	Уміст гемоглобіну в крові, г/л
1	–	3,0	контрольний розчин
2	1,0	2,0	50,0
3	2,0	1,0	100,0
4	3,0	–	150,0

Примітка. Вимірювання проводять проти контрольного розчину

Вміст гемоглобіну в крові тварин різних видів коливається у значних межах (табл. 25).

Таблиця 25 – Уміст гемоглобіну в крові тварин

Вид тварин	г/100 мл	г/л	Вид тварин	г/100 мл	г/л
Велика рогата худоба	9,5–12,5	95–125	Качки	10,0–12,5	100–125
Вівці	9,0–13,5	90–135	Гуси	9,0–13,5	90–135
Кози	10,0–15,0	100–150	Індики	7,0–11,0	70–110
Коні	9,0–14,0	90–140	Кролі	10,5–12,5	105–125
Свині	9,0–11,0	90–110	Норки	15,0–17,5	150–175
Собаки	14,0–21,0	140–210	Песці	12,0–17,0	120–170
Коти	10,0–14,0	100–140	Соболі	13,0–16,0	130–160
Кури	8,0–12,0	80–120	Лисиці сріблясто-чорні	12,0–16,0	120–160

Збільшення вмісту гемоглобіну в крові тварин – плейохромія, гіперхромемія – спостерігається при згущенні крові (діарея, утворення ексудатів, транссудатів), серцево-легеневій недостатності і збігається, як правило, зі збільшенням кількості еритроцитів.

Зменшення кількості гемоглобіну – олігохромемія – спостерігається при анеміях різного походження, причиною яких є дефіцит міді, кобальту, заліза, вітамінів В₂, В₁₂, В_с, С, кровотечі, посилений гемоліз еритроцитів при піроплазмідозах, лептоспірозі, інфекційній анемії коней, пригнічення функції кісткового мозку різними токсинами.