5.3. Визначення α-амілази (за методом Каравея)

Принцип методу. Метод грунтується на визначенні залишку нерозщепленого α-амілазою крохмалю. Концентрацію крохмалю визначають за кольоровою реакцією з йодом. Активність α-амілази пропор-ційна до зменшення інтенсивності забарвлення при 640 нм.

Обладнання: фотоелектроколориметр (КФК-2, КФК-3), спектро-фотометр, водяна баня, пробірки, піпетки.

Реактиви: 1) концентрований субстратно-буферний розчин, чда (0,5 %-ний розчин крохмалю, розчиненого в 0,25 М Тріс-HCl буфері, рН 7,1);

2) концентрований розчин йоду, ч – 0,1 M J (стійкий у темному місці);

3) концентрований стоп-розчин, 4 н HCl, ч.

Використовують набір реактивів НВФ "Simko Ltd" (м. Львів).

Приготування субстратно-буферного розчину. Один об’єм концентрованого розчину змішують з чотирма об’ємами дистильованої води (наприклад, до 10 мл концентрованого субстратно-буферного розчину додають 40 мл дистильованої води і перемішують).

Приготування робочого розчину йоду. Одержують у день використання розведенням концентрованого розчину у 50 разів (наприклад, 0,1 мл концентрованого розчину + 4,9 мл дистильованої води і перемішують).

Приготування робочого стоп-розчину. Одержують шляхом розведення концентрованого стоп-розчину в 40 разів (10 мл концентрованої соляної кислоти + 390 мл дистильованої води і перемішують). Розчин стійкий.

Відбір проб. 1. Використовують свіжу сироватку крові. Можливе використання гепаринізованої плазми.

2. Використовують профільтровану сечу, яку при активності понад 140 мг/(с  л) необхідно розвести ізотонічним розчином натрію хлориду в 2–100 разів.

3. Дуоденальний вміст перед визначенням потрібно розвести у 100 разів.

4. При розрахунку активності амілази враховують коефіцієнт розведення.

Хід визначення. Визначення α-амілази проводять згідно зі схемою (табл. 16).

Таблиця 16 – Схема визначення α-амілази

Розчин, мл	Дослідна проба	Контрольна проба
Субстратно-буферний розчин	0,5	0,5
Витримують на водяній бані при +37 °С протягом 5 хв
Сироватка	0,01	–
Витримують точно 7,5 хв на водяній бані при 37 °С
Стоп-розчин	4,0	4,0
Розчин йоду	0,5	0,5
Сироватка	–	0,01

Вимірюють поглинання дослідної і контрольної проб при 640 нм проти дистильованої води (можна використовувати довжину хвиль 630–690 нм або червоний світлофільтр; кювета – 10 мм).

Активність α-амілази розраховують за формулою:

α-амілаза, мг/(сл) =

де Е₁ – поглинання контрольної проби; Е₂ – поглинання дослідної проби;

44,4 – коефіцієнт перерахунку на 1 с інкубації і 1 л сироватки.

Примітка. 1 мг/(с  л) = 3,6 мг/(год  мл); 1 мг/(год  мл) = 0,278 мг/(с  л).

Діагностичне значення. Величини активності альфа-амілази у сироватці крові здорових тварин наведені у додатку Г. Альфа-амілаза (α-амілаза) каталізує ендогідроліз 1,4-глюкозидних зв’язків крохмалю, глікогену та інших споріднених з ними полісахаридів до мальтози, декстринів чи інших полімерів. Альфа-амілаза секретується підшлунковою та слинними залозами; невисока її активність спостерігається в печінці та скелетних м’язах. Низька молекулярна маса амілази ( 48000) сприяє фільтрації ферменту через ниркові клубочки і виділенню із сечею. Ензим складається із двох фракцій – панкреатичної та слинної. У сироватці крові вищою є активність слинного ізофермен-ту, а в сечі – панкреатичного. Підвищення активності амілази в сироватці крові та сечі спостерігається при пошкодженні слинних та підшлункової залоз. Значна та швидка гіперамілаземія і гіперамілазурія розвиваються при гострому перебігу паротиту та панкреатиту. Меншою мірою зростання активності альфа-амілази реєструється при виразках шлунка, хімостазі, дистрофії печінки, гепатиті, жовчнокам’яній хворобі. При патології нирок активність ферменту може зростати у крові, а в сечі – знижуватися. Гіперамілаземію спричинюють деякі лікарські препарати (кортикостероїди, саліцилати, тетрациклін, фуросемід, гістамін).