8. Дослідження обміну вітаміну а

Вітаміни – це незамінні фактори живлення, які виконують функцію біологічних каталізаторів, забезпечуючи розвиток організму тварин і людей. Джерелом вітамінів для тварин є переважно корми рослинного і меншою мірою – бактеріального та тваринного походження.

Сучасна класифікація вітамінів грунтується на їхніх фізико-хімічних властивостях, зокрема розчинності та хімічній природі. Залежно від розчинності, розрізняють вітаміни жиророзчинні (А, D, E, K) і водорозчинні (В₁, В₂, В₃, В₅, В₆, В₁₂, В_с, Н, С, Р). Окрім цих двох основних груп вітамінів, виділяють групу різноманітних хімічних сполук, що мають вітамінні властивості – вітаміноподібні речовини, до яких, зокрема, належать холін, вітаміни В₁₃ і В₁₅, інозит, убіхінон, карнітин, лінолева і ліноленова кислоти (вітамін F), вітамін U (S-метилметіонін), параамінобензойна кислота.

8.1. Визначення вітаміну а та каротину в сироватці

крові і молозиві (за методом Бессея О. в модифікації

Левченка В.І. зі співавт., 1998)

Принцип методу полягає у лужному гідролізі та екстракції вітаміну А і каротину з сироватки крові (молозива) за допомогою малолет-ких розчинників з наступним спектрофотометричним вимірюванням ступеня поглинання світла розчином до і після руйнування вітаміну А під дією ультрафіолетових променів.

Обладнання: СФ-16, СФ-46 або фотоелектроколориметри КФК-2, КФК-3, ртутно-кварцова лампа ДРТ-400, вентилятор настільний, водяна баня, пробірки центрифужні циліндричні та пробірки об’ємом 10 мл з притертими пробками зі скла “пірекс” або з кварцового скла, які пропускають ультрафіолетове проміння, піпетки.

Реактиви: 1) спирт етиловий 96;

2) калію гідроокис, хч;

3) ксилол, ч;

4) октан, хч.

Приготування реактивів: а) 11 N-ний розчин КОН у 96°-ному етанолі (для приготування 100 мл розчину КОН необхідно до 5,6 г КОН додати 6,0 мл дистильованої води, розчинити його і довести етанолом об’єм до 100 мл, після чого суміш старанно перемішати); б) ксилол-октанова суміш (аа), яку готують за кілька годин до роботи.

Хід визначення. У центрифужні пробірки вносять по 2 мл сироватки крові (молозива) і спиртового розчину КОН, перемішують тонкою скляною паличкою до утворення однорідної суміші. Пробірки ставлять для гідролізу у водяну баню на 20 хв при 60°С (через кожні 10 хв перемішують). Після гідролізу пробірки охолоджують протягом 10 хв у морозильній камері холодильника. У кожну пробірку додають по 4 мл ксилол-октанової суміші, пробірки закривають пробками, інтенсивно струшують протягом 2–3 хв, знову охолоджують 5–7 хв, а потім центрифугують 10–15 хв при 1500–3000 об/хв. Верхній шар, що містить екстракт вітаміну А і каротиноїдів у ксилол-октановій суміші, відбирають піпетками у пробірки зі скла “пірекс”. Фотометрію проводять у кюветі з товщиною робочого шару 10 мм, а для контролю використовують ксилол-октанову суміш. Визначення каротину на СФ-46 проводять при довжині хвилі 460 нм, ретинолу – 328 нм (на КФК-2 або КФК-3 відповідно 440 і 315 нм). Оптичну густину суміші для визначення вітаміну А вимірюють повторно після опромінення пробірок ультра-фіолетовими променями протягом 50 хв, для чого пробірки зі скла “пірекс” щільно закривають притертими скляними пробками і ставлять на віддалі 15–20 см від лампи ДРТ-400 або ПРК-5. Для охолодження пробірок під час опромінення використовують два настільні вентилятори. За різницею значень оптичної густини, отриманої при фотометрії до і після опромінення, визначають концентрацію вітаміну А у сироватці крові (молозиві).

Розрахунок проводиться за формулами:

вітамін А, мкг/100 мл = (Е₁ – Е₂) × 1274 (на СФ-16, СФ-46) або

(Е₁ – Е₂) × 1500 (на КФК-2, КФК-3),

де Е₁ – екстинція розчину до опромінення при довжині хвилі 315 нм; Е₂ – екстинція розчину після опромінення при довжині хвилі 315 нм; 1274 та 1500 – коефіцієнти для визначення вітаміну А;

каротин, мкг/100 мл = Е × 762 (на СФ-16; СФ-46) або

Е × 850 (КФК-2; КФК-3),

де Е – екстинція розчину при довжині хвилі 440 нм; 762 та 850 – коефіцієнти для визначення каротину.

Кількість каротину в сироватці крові залежить від віку і виду тварин. У новонароджених телят містяться сліди каротину, в одномісячних – 20–50 мкг/100 мл, у молодняку 3–6-місячного віку – 250–800, у тварин більш старшого віку і корів – 450–1250 мкг/100 мл. У пасовищний період уміст каротину може сягати 2 мг/100 мл сироватки. Незважаючи на те, що каротин засвоюється телятами з перших днів життя, оцінювати стан А-вітамінного обміну в телят за цим показником неможливо до 2–3-місячного віку, оскільки кількість його незначна, а зміни непоказові. У сироватці крові свиней, коней, кіз та овець каротин відсутній.

Кількість каротину в сироватці крові свідчить про надходження його з кормами, але він не є критерієм забезпеченості тварин вітаміном А. Навіть при низькому вмісті каротину в сироватці крові А-гіповітаміноз може не розвиватися, тому що до складу преміксу входить ретинол. За певних умов (нестача йоду) А-гіповітаміноз, навпаки, розвивається при нормальній кількості каротину в сироватці крові.

Низький уміст каротину в сироватці крові корів – гіпокаротинемія (менше 450 мкг/100 мл) – є показником недостатнього надходження провітаміну у складі кормів раціону, руйнування його антивітамінами в передшлунках і кишечнику, порушення засвоєння у тонких кишках при їх запаленні або патології печінки. Критичним рівнем для корів є вміст 300–350 мкг у 100 мл сироватки крові (Душейко А.А., 1989; Левченко В.І., Сахнюк В.В., 1996).

Зважаючи на обмежену діагностичну інформативність визначення каротину, в практиці ветеринарної медицини останнім часом все більшого значення набуває визначення ретинолу в різних субстратах: сироватці крові, молозиві, печінці, жовтках яєць. У здорових новонароджених телят у перший день життя концентрація вітаміну А в сироват-ці крові становить 4–12, у 5–10-денних – 9–15 мкг/100 мл, місячного віку –12,5–25 (Левченко В.І., Сахнюк В.В.), тримісячного – 15–35, у 6–12-місячного молодняку –30–80 (Щуревич Г.О., 1986), у корів у стійловий період –25–80, літній –40–150; у вівцематок і коней – 15–25; у новонароджених поросят –10–40, поросят-сисунів до місячного віку –15–50, відлучених та свиней на відгодівлі – 30–70, свиноматок –20–50; у птиці – 50–230 мкг/100 мл.

А-вітамінна недостатність розвивається за вмісту ретинолу в сироватці крові телят місячного віку менше 12 мкг у 100 мл, 2– 3-місячного – 15, молодняку – 20, корів – 25, овець – 12, свиней – 15, коней – 10, птиці – 25 мкг/100 мл; у печінці одноденних курчат і гусенят менше 20 мкг/г, каченят – 15, індиченят – 30 мкг/г; у жовтках яєць курей менше 6 мкг/г, індиків – 7, качок – 8, гусей – 10 мкг/г. Мінімальний уміст каротину в 1 г жовтка яєць курей та індичок 15 мкг, качок і гусей – 20 мкг. У молозиві корів, свиноматок і вівцематок у перший день лактації має міститися не менше 3 мг ретинолу в 1 л. Критичний уміст ретинолу в молозиві першого–другого надоїв становить 2,3 мг/л.