Тема 7. Определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам. Бактериофаги

По происхождению различают антибиотики, продуцируемые грибами и лишайниками (пенициллин, гризеофульвин и др.), акта-номицетами (стрептомицин, неомицин, тетрациклин, эритроми­цин и др.), бактериями (грамицидин, полимиксин, тиротрицин, субтилин и др.), высшими растениями (аллицин, фитоалексин, препараты алоэ, фитонциды лука, чеснока и др.) и антибиотики животного происхождения (лизоцим, эритрин, экмолин и др.).

В лечебной практике антибиотики делят по их спектру дей­ствия: действующие преимущественно на какую-то одну группу микроорганизмов (например, на грамположительные или грамот-рицательные) или на разные группы микробов. Антибиотики из­готавливают промышленным путем в виде солей калия, натрия, кальция и выпускают в специальных упаковках. Во всех случаях перед выпуском препарата определяют его активность. Нередко приходится определять и концентрацию антибиотиков в исследу­емом материале.

Биологическую активность антибиотиков выражают в услов­ных единицах (ЕД), содержащихся в I мл раствора (ЕД/мл) или в 1 мг препарата (ЕД/мг). За единицу антибиотической активности принимают минимальное количество антибиотика, которое по­давляет рост стандартного тест-микроба в определенном объеме питательной среды. Для установления активности каждого анти­биотика используют свойственный для него тест-микроб: для пе­нициллина—золотистый стафилококк 209-Р, для стрептомицина и тетрациклина — штаммы Вас. subtilis, для биомицина, левомице-тина — Е. сой. Установлено, что 1 мг чистого основания стрепто­мицина эквивалентен 1000 ЕД, следовательно, 1 ЕД эквивалентна 1 мкг данного антибиотика.

Единица биологической активности не у всех антибиотиков одинаковая: 1 ЕД неомицина эквивалентна 3,3 мкг, пеницилли­на — 0,6 мкг, бацитрацина — 20 мкг чистого вещества. Весовое ко­личество антибиотика, эквивалентное одной единице биологичес­кого действия его, называют международной единицей действия (ME).

Активность антибиотиков определяют химическим, но чаше биологическим методом, в основе которого лежит установление интенсивности прямого воздействия препарата на живую микроб­ную клетку. Для этих целей применяют метод серийных разведений в жидких и плотных питательных средах. В штатив ставят 20 пробирок в два ряда и в каждую вносят по 1 мл среды. В пробирках первого ряда готовят последовательные разве­дения стандартного антибиотика, для чего в пробирку добавляют 1 мл антибиотика, раствор перемешивают и 1 мл его переносят в следующую пробирку и т. д. В две последние пробирки антибио­тик не вносят, они служат контролем. В пробирках второго ряда по той же методике разводят испытуемый антибиотик. Затем во все пробирки обоих рядов добавляют тест-микроб в соответствую­щей концентрации. Пробирки выдерживают в термостате при 37 "С 18..,24 ч. Наименьшее количество (наибольшее разведение) препарата, в котором отсутствует рост тест-микроба, сопоставля­ют с таким же разведением стандартного антибиотика и определя­ют содержание его в 1 мл арифметическим подсчетом, принимая во внимание степень разведения.

В лабораторных условиях применяют чашечный (или кольцевой) метод с использованием бумажных дисков, про­питанных растворами различных концентраций испытуемого ан­тибиотика.

Техника выполнения. Готовят серию последовательных разведе­ний испытуемого препарата в пробирках на физиологическом растворе (1:10, 1:100, 1:1000, 1 :10000 и т.д.). В несколько ча­шек Петри со стерильным агаром сплошь по всей поверхности вы­севают культуры тест-микроба.

Дно чашки карандашом по ^рж-³⁸- ^Посев культуры шпателем стеклу разделяют на четыре секто­ра. В центр каждого сектора на засеянный агар кладут стерильный бумажный диск (диаметр 0,6 см), пропитанный раствором антиби­отика соответствующей концентрации. Чашки Петри выдержива­ют в термостате при 37 °С 16...18ч. Вокруг дисков в зависимости от активности и концентрации антибиотика в растворе образуют­ся разной ширины зоны задержки роста тест-микроба (см цв. рис. V). Наименьшие зоны точно измеряют с помощью циркуля и линейки. Параллельно исследуют стандартные антиби­отики с известной активностью.

Для каждой концентрации стандартного и испытуемого анти­биотика вычисляют среднее арифметическое число. Активность рассчитывают по стандартной кривой или по специальным табли­цам. Для выбора наиболее эффективного антибиотика определяют чувствительность (антибиотикорезистентность) возбудителя бо­лезни к нескольким антибиотикам.

В стерильные чашки Петри с ровным дном наливают по 20 мл МПА или агара на переваре Хоттингера с содержанием 120— 140 мг% аминного азота; рН среды 7,2...7,4. Исследуемую культуру возбудителя, выделенного из патологического материала, смыва­ют с агара физиологическим раствором, готовят 1-миллиардную взвесь и 1 мл ее засевают сплошным слоем по всей поверхности агара. Излишек жидкости отсасывают пипеткой. Засеянные чаш­ки подсушивают в термостате 15...30 мин при 37 °С. Бумажные диски, пропитанные разными антибиотиками (лучше фабричного производства), раскладывают на засеянный агар стерильным пин­цетом на расстоянии 2 см от края, слегка прижимая к среде. В од­ной чашке можно испытать 4...5 антибиотиков. Чашки с дисками выдерживают при комнатной температуре (не выше 20 °С) 2...3 ч, затем 14...15 ч в термостате при 37 °С. Учет результатов производят по величине зоны задержки роста микробов вокруг бумажных дисков, включая их диаметр. Если зона задержки роста составляет 15...25 мм, то считают, что микробы чувствительны к антибиоти­ку, до 15 мм — малочувствительны; отсутствие такой зоны указы­вает на резистентность бактериальной культуры к данному анти­биотику (чувствительность отсутствует).

Для выявления антибиотикоустойчивых штаммов бактерий ис­пользуют метод диффузии в агаре с применением дисков. Более точное исследование проводят методом серийных разведений в соответствии с «Указаниями по определению чувствительности к антибиотикам возбудителей инфекционных болезней сельскохо­зяйственных животных».

Бактериофаги. Это вирусы бактерий, характеризующиеся обли-гатным паразитизмом, малой величиной (10...350 нм), специфи­ческими антигенными свойствами. Паразитизм бактериофагов проявляется только в молодой бактериальной культуре, гомо­логичной (специфичной) фагу. Бактериофаги можно выделить из различных материалов, где содержатся живые микробы (из сточ­ных вод, раневых секретов, фекалий животных и человека, по­чвы). Называют фаги по виду лизируемого ими микроба (фаги ки­шечной палочки, сальмонелл).

Для выделения фага исследуемый материал пропускают через бактерийные фильтры. Фильтрат вносят в колбу с МПБ и засева­ют определенным видом бактерий. Ставят в термостат при 37 X на 16,.Л 8 ч, а затем культуру вновь фильтруют и проверяют на на­личие фага. С этой целью в 10 мл МПБ засевают 0,05 мл густой взвеси бактерий, добавляют 0,1 мл исследуемого фильтрата и по­мещают в термостат. Каждые два часа проверяют степень роста культуры (по образующейся мутности среды), сравнивая с конт­рольной пробиркой МПБ (та же культура, но без фильтрата). В первые часы инкубирования в опытных контрольных пробирках отмечают рост культуры, но в последующем в растущей культуре развившийся фаг лизирует молодую культуру и в пробирках с до­бавленным фильтратом наступает просветление, мутность исчеза­ет; в контрольных пробирках мутность увеличивается из-за обиль­ного роста культуры.

Наличие фага можно определить и на плотных средах. На по­верхность скошенного в пробирке МПА засевают микробную культуру так, чтобы она покрывала всю поверхность среды; подсу­шивают и наносят 1...2 капли фильтрата, давая им стечь сверху вниз по поверхности засеянной среды. Культуру ставят в термо­стат на 18...20 ч. При наличии фага, гомологичного засеянной культуре, по следу протекавшей капли фильтрата (фага) бактерии не растут, образуется своего рода «дорожка», вокруг которой отме­чают обильный рост бактерий.

Учитывая специфичность фагов, их используют для диагности­ческих целей, идентификации бактериальных культур, выделяе­мых из исследуемого материала. При необходимости для опреде­ления активности фага применяют специальные методы.

Репродукция многих бактериофагов в клетке приводит к ее ли­зису. На специфической адаптации фагов к строго определенным видам (штаммам) бактерий и внешнем проявлении поражения бактериальных клеток (лизис) основано практическое использо­вание бактериофагов: при помощи известного (диагностического) фага можно обнаружить и идентифицировать бактерии. Кроме того, биологическая промышленность выпускает лечебно-профи­лактические бактериофаги.

Идентификация бактерий с помощью фагов. Фаги применяют для видовой (возбудитель сибирской язвы, листериоза и др.) или внутривидовой идентификации бак­терий — установление фаговара конкретного бактериального штамма.

Для идентификации неизвестной культуры бактерий при по­мощи диагностического бактериофага обычно используют плотную питательную среду. Например, исследуемую 18-часо­вую культуру, предположительно листерий, засевают в МПБ с глюкозой, инкубируют при 37 °С 4 ч до легкой опалесценции среды и затем засевают газоном (0,1 мл) на подсушенный 2%-й МПА в чашку Петри. Через 1...1,5ч инкубирования посевов при 37 "С при слегка приоткрытой крышке на одну половину газона наносят каплю листериозного бактериофага 2А и на вто­рую половину помешают каплю фага 4А. Посевы инкубируют при 22...25°С 16...24 ч. Учет результатов: если культура листери-озная, то на месте нанесения хотя бы одного фага видна про­зрачная зона лизиса.

Для установления фаговара исследуемую культуру проверяют с набором типовых фагов, охватывающих все фаговарианты данно­го вида бактерий, определяют, к какому фагу чувствителен дан­ный штамм, что и служит его маркером.

Для идентификации микробов в объектах окружающей среды и диагностики инфекционных болезней используют метод нара­стания титра фага, который позволяет обнаружить возбудителя непосредственно в исследуемом материале в присутствии посто­ронней микрофлоры. Для этого навеску исследуемого материала без консерванта заливают МПБ в 10-кратном объеме (рН 6,8...7,0), встряхивают со стеклянными бусами 5 мин в шуттель-аппарате и разливают в две пробирки по 9 мл. В первую пробир­ку добавляют 1 мл индикаторного фага известного титра в разве­дении 1 : 100, в другую — 1 мл бульона (контроль на наличие сво­бодного фага), в третью пробирку (контроль титра фага) — 9 мл стерильного МПБ и 1 мл фага. Пробирки помещают в термостат при 37 "С на 4...5 ч. При наличии в материале микроорганизмов гомологичного фага происходит нарастание титра фага. Затем содержимое каждой пробирки разводят бульоном в 100, 1000 и 10 000 раз при 58 "С, 30 мин прогревают в водяной бане и иссле­дуют по методу агаровых слоев с индикаторной культурой. Ре­зультат учитывают через 4...5 ч по колониям фага («пятнам»). Положительным результатом считают тот, при котором титр фага в опытной пробирке увеличивается более чем в 5 раз по сравнению с контролем.

Методика рекомендуется при исследовании воды, почвы, мо­лока и другого материала.