Тема 15. Бруцеллы и возбудитель туляремии

Возбудитель бруцеллеза. Впервые был открыт и описан Брюсом

(1886), в честь которого этот микроорганизм получил родовое на­звание Brucella, а семейство — Brucellaceae. В патологии животных имеют значение Brucella melitensis, В. abortus, В. suis. Названные виды бруцелл имеют культурально-морфологическое сходство, общие антигены. При гибели, разрушении бруцелл освобождают­ся эндотоксины. Бруцеллы являются возбудителями инфекцион­ного (контагиозного), хронически протекающего заболевания у животных и человека — бруцеллеза. Болезнь проявляется абортом, а также возможно воспаление суставов, орхиты. Чаще заболевание протекает бессимптомно. Особой патогенностью для человека (и мелкого рогатого скота) обладает В. melitensis. Основные методы диагностики бруцеллеза: бактериологический (особенно при на­личии абортов), серологический и аллергический.

Бактериологическое исследование. При жизни животного посылают абортированный плод (или перевя­занный с двух сторон желудок плода с содержимым), истечение из родовых путей, плодные оболочки или кусочек плаценты, около­плодную жидкость, молоко. Посмертно (после убоя) в лаборато­рию направляют трубчатую кость (костный мозг), кусочки пече­ни, почки, селезенки, молочной железы, лимфатические узлы, матку. По мере необходимости отправляют также пробы воды, по­чвы, подстилки. При взятии материала от животных необходимо соблюдать правила асептики и личной гигиены. Кусочки тканей можно консервировать в 30 %-м глицерине.

Микроскопия. Препараты из присланного материала фиксируют; часть из них окрашивают по Граму, часть — специ­альным методом (Козловского, Шуляка и др.). По методу Козлов­ского препараты, фиксированные над пламенем горелки, окраши­вают свежеприготовленным горячим 2%-м раствором сафранина (если раствор остыл, его наливают на препарат и подогревают снизу до появления паров в течение 3...5 мин. Затем краску слива­ют и докрашивают 1%-м водным раствором малахитовой (или бриллиантовой) зелени (около 1 мин). По методу Шуляка фикси­рованный мазок окрашивают 2 мин карбол-фуксином (1 : 5), слег­ка промывают и докрашивают 2%-м водным раствором метилено-вой сини — 3...5 мин.

Морфология. Бруцеллы — мелкие палочковидной (кок-коподобной) формы бактерии, 0,6...1,5мкм длиной, 0,3...0,5 мкм в диаметре. Споры не образуют. Неподвижны. По Граму красятся отрицательно, по методу Козловского (или Шуляка) — в красный цвет; остальные микробы — в зеленый (или синий) цвет. В препа­рате располагаются изолированно или небольшими скоплениями.

Выделение чистой культуры. Культу-ральные свойства. Из различных участков патологичес­кого материала пипеткой производят посев на жидкие и плотные питательные среды: глюкозо-печеночные, сывороточные, на кар­тофельные среды с добавлением глицерина, глюкозы; рН среды 7,0...7,2. В первичных посевах рост бруцелл проявляется медленно при длительном инкубировании в термостате при 37 "С. Учитывая, что одни виды бруцелл аэробы, а другие — микроаэрофилы (В.abortus), для получения первичных культур посевы помещают в термостат в обычных условиях, другую часть — сначала в эксика­тор с повышенным содержанием диоксида углерода (до 10...20 %), а затем уже в термостат. Рост появляется спустя 30...40 сут, самое раннее —на 7... 10-е сутки. По мере адаптации к искусственным средам бруцеллы растут более быстро (1...2сут).

На МППА рост проявляется мелкими прозрачными колониями с ровными краями, с голубоватым оттенком, которые впослед­ствии сливаются и образуют сплошной мутный сероватый налет. Колонии — S- и R-формы. На картофеле нередко колонии пиг­ментированы (коричневого цвета). Типичные колонии пересева­ют па специальные питательные среды. Полученную чистую куль­туру проверяют на биохимическую активность, а также проводят серологическую идентификацию посредством РА на стекле со специфической сывороткой в разведении 1: 2...1: 50.

В МПБ рост вначале в виде равномерного помутнения, в дальнейшем образуются пристеночное кольцо и небольшой осадок. Для получения чистой культуры бруцелл из загрязнен­ного материала следует сделать посев на селективную среду Козловского (МППА с глюкозой, генцианвиолетом и малахито­вой зеленью).

Биохимические свойства выражены слабо. Же­латину и свернутую сыворотку бруцеллы не разжижают, индол не образуют. Сероводород и аммиак образуют лишь в зависимости от вида и штамма. В. suis обильно продуцирует сероводород, а В. abortus— менее интенсивно. Молоко не свертывают.

Биопроба осуществляется заражением морских свинок, которых предварительно подвергают серологическому контролю. В случае отрицательного результата животным инъецируют под­кожно 1...2мл суспензии из тканей присланного материала — свинка не погибает. Через 8...10 сут у зараженной свинки берут кровь (в случае отрицательного или сомнительного результата кровь берут повторно через 20...30 сут), исследуют в РА в разве­дении 1: 5...1: 10 (до 1: 80). Положительный результат РА в раз­ведении 1: 6... 1 : 10 указывает на инфицированность морской свинки. По истечении 30...45 сут после заражения свинку убива­ют и исследуют бактериологически. При отрицательном резуль­тате РА морских свинок убивают спустя более длительный пери­од (6...8 нед) и бактериологически исследуют их ткани и органы. Обязательно делают посев из паховых, подчелюстных, шейных, брыжеечных лимфоузлов, печени, селезенки, почек, костного мозга.

Методы дифференциации видов бруцелл. Для дифференциации используют чистые культуры бруцелл, об­разующие S-форму колоний.

Проба с трипафлавином. Бактериологической петлей берут мик­робную массу 48-часовой агаровой культуры и эмульгируют на предметном стекле в капле трипафлавина, разведенного физиоло­гическим раствором NaCl 1 : 500. Если культура диссоциирована, быстро наступает агглютинация с образованием хлопьев. Недис-социированная культура при эмульгировании в капле образует го­могенное помутнение; хлопья не выпадают.

Окраска колоний кристаллвиолетом. В культуру, выросшую в чашке Петри, пастеровской пипеткой вносят краску в разведении 1 : 2000, приготовленную ex tempore. Через 5 мин после отсасыва­ния краски из чашки колонии просматривают под лупой. Диссо­циированные R-формы бруцелл окрашиваются от темно-фиоле­тового до светло-синего цвета, S-формы — в светло-желтый или светло-зеленый цвет.

Реакция термоагглютинации. В пробирке 2...3-миллиардную взвесь бруцелл (смыв с агаровой культуры) прогревают в водяной бане при 90 °С в течение 45 мин и оставляют при комнатной тем­пературе. Результат учитывают через 30 мин, затем через 1 ч и окончательно через 24 ч. В диссоциированной культуре четко за­метна агглютинация. Если колонии типичны (S-формы), их пере­севают в пробирки на скошенный МПА. Выросшую культуру идентифицируют по следующим показателям: 1) отношение к ди­оксиду углерода — В. abortus для своего роста нуждается в повы­шенном содержании СО₂ (до 10 %.), Br. melitensis и В. suis хорошо растут в обычных условиях; 2) образование сероводорода — наибо­лее интенсивно и более продолжительное время проявляется у В. suis, в меньшей степени — у В. abortus. В. melitensis, как правило, не продуцирует сероводород.

Бактериостатический метод. Дифференциация видов бруцелл основана на отношении к растворам красок, добав­ленных к питательным средам.

В пробирки с красками (каждой в отдельности) — фуксин (1:25 000), тионин (1:50 000...! : 100 000), добавленными к МППА,— высевают чистую культуру бруцелл. На среде с фукси­ном не растет В. suis, на среде с тионином не растет В. abortus. В. melitensis хорошо растет в присутствии этих красок.

Серологическая диагностика. В лабораторию направляют сыворотку крови. Последнюю исследуют с бруцеллез­ным антигеном методами РА и РСК. В производственных услови­ях в настоящее время используют методику исследования сыворо­ток по методу Кумбса. Все шире используют метод флуоресциру­ющих антител.

Аллергическая диагностика. В хозяйствах осно­вана на применении аллергенов — бруцеллизата, бруцеллогидро-лизата, бруцеллина. Последние в дозе 0,2 мл вводят внутрикожно и через 24...48 ч учитывают местную реакцию.

Биопрепараты, Живая сухая вакцина против бруцеллеза из слабоагглютиногенного штамма № 82: отличается слабым серо­логическим ответом с быстрым снижением уровня гуморальных антител, что позволяет при помощи серологических реакций диф­ференцировать вакцинированных животных.

Высокоэффективна новая вакцина 75/79 АВ.

Единый бруцеллезный антиген для РА, РСК и РДСК из культу­ры вакцинного штамма № 19.

Антиген для кольцевой реакции с молоком: микробную массу культуры В. abortus (штамм № 19) готовят, как для единого бру­целлезного антигена, инактивируют, устанавливают необходимую концентрацию микробных клеток, протравливают сульфатом же­леза, окрашивают в синий цвет гематоксилином, контролируют на стерильность, специфичность и активность.

Роз-бенгал антиген представляет собой суспензию бруцелл в буферном растворе (рН 3,6), инактивированных нагреванием и фенолом, окрашенных бенгальским розовым в малиново-розовый цвет.

Флуоресцирующая бруцеллезная сыворотка: готовят из пози­тивной бруцеллезной сыворотки, глобулины которой метят флуо-ресцеинизотиоцианатом.

Позитивная бруцеллезная сыворотка: получают гипериммуни­зацией животных-продуцентов. Используют для контроля при по­становке серологических реакций (РА, РСК и др.), а также серо­логической идентификации бруцелл.

Диагностический аллерген бруцеллин представляет собой сте­рильную, прозрачную, желтоватого цвета жидкость, содержащую продукты жизнедеятельности бруцелл и вещества, извлеченные из них

Возбудитель туляремии (Francisella tularensis). Открыт Мак-Коем и Чепиным (1912) в районе Туляре (Калифорния). Подробно изу­чен Френсисом (1921), в честь которого дано родовое название возбудителю. Относится к семейству Brucellaceae, роду Francisella. F. tularensis вызывает острое инфекционное заболевание животных и человека. Туляремия характеризуется септическим течением, поражением лимфатических узлов (набухание, творожистое пере­рождение), лихорадкой.

Бактериологическое исследование. В лабо­раторию при жизни животного посылают пунктат из увеличенных (мягких) лимфоузлов, абортированный плод (или органы плода), мочу, кал; после гибели животного — печень, почку, селезенку, увеличенные лимфоузлы от крупных животных. Трупы грызунов и других мелких животных направляют целиком.

Следует учитывать, что обнаружить возбудитель туляремии в препаратах-отпечатках возможно лишь при обильном обсемене­нии исследуемого материала.

Микроскопия. F. tularensis — мелкая коккоподооная бак­терия в мазках из культуры и тонкая палочка — в препаратах из органов. Величина 0,3 мкм. Споры не образует, неподвижная. В макроорганизме образует нежную капсулу. Грамотрицательна. По Романовскому — Гимза окрашивается в розово-голубой цвет, час­то биполярно.

Культуральные свойства. Аэроб. Оптимальная температура роста 37 °С, рН среды 6,7...7,4. На средах с кровью через 1...2сут появляются мелкие колонии беловатого цвета с го­лубоватым оттенком, круглые, выпуклые, с ровными краями, гладкие, блестящие. На жидких средах растет плохо. При культи­вировании следует учитывать, что для колоний типична гладкая S-форма, обладающая Vi- и О-антигенами, вирулентная и иммуно-генная. R-форма F. tularensis содержит лишь О-антиген. Авирулен-тна. При серологической диагностике учитывают наличие в бакте­рийной клетке антигенов, общих с бруцеллами. Для культивирования F. tularensis применяют специальные питатель­ные среды, такие, как желточная среда Мак-Коя, шоколадный агар Фрэнсиса, кровяная среда Емельяновой и др.

Среда Мак-Коя: на 60 частей куриных желтков добавляют 40 ча­стей стерильного физиологического раствора (дистиллированную воду для физраствора подщелачивают до рН 7,0...7,2). Для сверты­вания среду выдерживают при 80 °С 1 ч. Посев на среду произво­дят методом отпечатков: кусочек органа обжигают, разрезают сте­рильными ножницами и поверхность разреза прикладывают к по­верхности среды. Рост наблюдают уже через 18...24ч, максималь­ный рост —через 2...3сут. При слабом посеве отмечают редко расположенные колонии на З...6-е сутки.

Среда Фрэнсиса: к МПА с 1 % пептона и 0,5 % NaCl <pH 7,3) добавляют 0,1 % цистина и 1 % глюкозы. Кипятят несколько ми­нут, затем охлаждают до 50 °С и добавляют 10 % дефибринирован-ной стерильно полученной крови кролика.

Среда Емельяновой: в рыбно-дрожжевой агар вносят ОД % цис­тина и 1 % глюкозы. Затем агар расплавляют, охлаждают до 45 "С, добавляют 10 % дефибрированной крови и разливают по чашкам Петри или в пробирки. Данная среда более чувствительна, при­годна для получения изолированных колоний возбудителя туляре­мии.

Биохимические свойства. Выражены слабо, но на специальных питательных средах с пониженным содержанием белка F. tularensis ферментирует с образованием кислоты без газа глюкозу, мальтозу, маннозу, глицерин, декстрин. Обладает проте-олитическими свойствами — расщепляет белки с образованием сероводорода. Индол не образует.

Биопроба. Белых мышей и морских свинок заражают сус­пензией растертых тканей патологического материала подкожно, в брюшную полость (в дозе 0,5 мл) или втиранием в кожу. Белые мыши погибают на 3...4-е сутки (иногда на 8 ...12-е сутки), морс­кие свинки — через 4...5 сут. Если материал инфицирован незна­чительно, гибель возможна на 8...15-е сутки. При вскрытии у павших лабораторных животных отмечают некротические очаги в легких, селезенке, печени, лимфатических узлах; их исследуют бактериологически.

Выделенную культуру идентифицируют пробирочным методом РА. В качестве антигена используют двухсуточную культуру, выра­щенную на среде Мак-Коя. Микробную массу снимают петлей (смывать нельзя), суспендируют в физиологическом растворе, дово­дят концентрацию до 5 млрд микробных клеток в 1 мл по стандарту для туляремийного микроба. Микробную взвесь в дозе 0,5 мл вносят в пробирки со специфической сывороткой в разных разведениях (не менее чем до 1:2000), встряхивают, помещают на 2 ч в термостат, за­тем оставляют при комнатной температуре на 20...22 ч. Положитель­ным результатом считают четко выраженную агглютинацию при полной прозрачности жидкости над агглютинатом.

Серологическая диагностика. Применяют РСК, как очень чувствительную, и РП для быстрой диагностики заболевания грызунов и пушных зверей. Антигеном служит экст­ракт из измельченных тканей поступившего в лабораторию трупа.