Тема 23. Возбудитель актиномикоза

Возбудитель актиномикоза — Actinomyces bovis. Актиномикоз характеризуется образованием в различных тканях медленнорас­тущей плотной ограниченной припухлости — актиномикомы. В образовании актиномикомы могут участвовать и другие актино-мицеты. A. israeli — грамположительный микроорганизм. В есте­ственных условиях в основном восприимчив крупный рогатый скот, но отмечены случаи заболевания актиномикозом свиней. Болеет актиномикозом и человек.

Лабораторная диагностика. На исследование на­правляют воспалительный экссудат и кусочки пораженной ткани из актиномикомы (при наружных поражениях), а при убое — ку­сочки пораженных органов. Исследование заключается главным образом в микроскопии препаратов-мазков и в случае необходи­мости в посеве на питательные среды. Установлено, что при внут­римышечном заражении 5...7-суточных крольчат у них появляют­ся актиномикозные поражения спустя 2О...25сут, в пораженной ткани и экссудате которых обнаруживают возбудителя.

Возбудитель актиномикоза морфологически неоднороден в культуре и в пораженной ткани. В патологическом материале нахо­дят «зернышки» серо-грязного цвета — «друзы». Препаровальными иглами берут несколько зерен и раздавливают их между двумя пред­метными стеклами. Один препарат накрывают покровным стеклом и рассматривают в неокрашенном виде при среднем увеличении под сухим объективом, другой мазок красят по Граму. В «друзе» центральная часть гриба представляет собой густое переплетение нитей мицелия в виде клубка, а вокруг центральной части — була­вовидные радиальные разрастания. Центральная часть — жизнеспособная, при пересевах дает рост гриба, периферическая часть— дегенерированная, омертвевшая и при посевах на питательные среды роста не дает. При окраске центральная часть окрашивается грампо-ложительно, а наружные разрастания измененного мицелия — грам-отрицательно. В препаратах из культур A. bovis видны разветвления одноклеточного тонкого несептированного мицелия диаметром 0,6...0,7 мкм. Мицелий окрашивается грамположительно.

Культивирование и культуральные свой­ства. A. bovis растет на средах плотных и жидких с добавлением сыворотки крови. Аэроб. Оптимальная температура роста 37 °С. Растет медленно— 1...2 нед. На плотных средах (сывороточный МПА, МПЖ) сначала появляются мелкие прозрачные колонии, приобретающие со временем беловато-серый цвет. По мере даль­нейшего роста колонии становятся сухими, плотными, с неровной поверхностью, врастающие в среды. При старении культуры коло­нии как бы посыпаны порошком мела. В жидкой среде (сыворо­точный МПБ) рост характеризуется образованием осадка в виде зернышек —это густое сплетение нитей мицелия. По мере старе­ния культуры на поверхности бульона появляется морщинистая пленка желтоватой окраски, среда остается прозрачной. Вырос­шую культуру используют для внутримышечного заражения крольчат, которых через З...4нед убивают и исследуют с целью диагностики актином икоза.

Тема 24. Патогенные спириллы

Возбудитель кампилобактериоза. Это бактерии семейства Spirillaceae, рода Campylobacter. Основные виды: C.fetus (подвиды С. fetus venerealis и C.fetus sb.fetus), C.jejuni, С. sputorum (подвиды С. sputorum sputorum, С. sputorum bubulus, С sputorum faecalis) и непато­генный С. coli. C.fetus sb. fetus вызывает аборты у овец, крупного ро­гатого скота. C.fetus sb. veneralis — патогенен для крупного рогатого скота. C.jejuni вызывает аборты у овец, энтериты у телят, ягнят и других животных. С. mucosalis патогенен для свиней; выделяют при признаках некротического энтерита и локального илеита.

Бактериологическое исследование. Включа­ет в себя обнаружение возбудителя в исходном материале методом световой микроскопии, выделение чистой культуры посевом на питательные среды и идентификацию возбудителя по культураль-но-морфологическим, ферментативным, серологическим свой­ствам.

В лабораторию направляют абортированный плод целиком с плодными оболочками или от крупных плодов голову, желудок, легкие, печень; у абортировавших животных — плаценту, слизь из шейки матки, взятую стерильно в первые З...4сут после аборта или в период охоты; от быков-производителей — препуциальную слизь и секрет придаточных половых желез; от убитых с диагнос­тической целью животных — матку, влагалище, лимфоузлы тазо­вой области.

Микроскопия. Представители рода Campyhbacter — грам-отрицательные полиморфные тонкие палочки, изогнутые в виде «крыла чайки», запятой, спирали с одним или несколькими завит­ками, или S-образные. Средние размеры (0,5...8) х (0,2...0,8) мкм. Подвижны за счет одного полярного жгутика на одном или обоих концах клетки; движение винтообразное. Спор и капсул не обра­зуют.

В мазках от животных, подвергавшихся лечению, располагают­ся в виде длинных спирилл, малоизвитых нитей и мелких кокко-видных форм.

Культурально-биохимические свойства. Возбудитель — микроаэрофил; температурный оптимум роста 37...38 "С. Для получения культуры кампилобактерий используют полужидкие и плотные питательные среды: плотный 2...3 %-й МППА и полужидкий 0,2 %-й мясопеченочный пептонный агар (ПЖА), среду Китта—Тароцци без масла, агар Мартена, сафрани-но-железо-новобиоциновую (СЖН) среду. Для обогащения в пита­тельные среды добавляют 5... 10 % дефибринированной крови круп­ного рогатого скота, овец, кроликов или сыворотку крови лошади. Культивируют в течение 6...10сут в микроаэрофильных условиях при замене 10...15% воздуха оксидом углерода. Контаминирован-ный материал высевают на среду СЖН: полужидкий агар — 0,5 мл, 2 %-й раствор сульфата железа — 5 мл, 0,5 %-й водный раствор саф­ранина Т —5 мл и 0,2%-й водный раствор новобиоцина — 5 мл. Среду фильтруют через бумажный фильтр, разливают в пробирки и автоклавируют 25 мин при 115 °С. Готовая к использованию среда должна быть розового цвета; рН 6,8. При культивировании на дан­ной среде кампилобактерий ее цвет не изменяется, другой микро­флоры — приобретает ярко-желтую окраску.

Каждую пробу высевают, растирая шпателем по поверхности среды, в нескольких чашках Петри. Выросшие колонии пересева­ют на полужидкий кровяной, сывороточный агар или среду Китта — Тароцци для получения чистой культуры.

При первичном выделении на плотной среде кампилобактерий образуют через 3...4 сут колонии (гладкие, бесцветные, диаметром мм или шероховатые, непрозрачные, белые или кремовые до мм в диаметре, или плоские, серые или светло-коричневые с не­ровными краями); редко в виде тонкого налета. На кровяном агаре гемолиз отсутствует. При росте на сывороточном бульоне дают слабое помутнение, иногда с образованием незначительного рыхлого осадка. На полужидком агаре растут в виде серовато-голубого диска около поверхности среды.

У выделенных культур кампилобактерий изучают фермента­тивную активность, ростовые потребности и на основании полученных данных идентифицируют их на уровне вида, подвида, био­вара.

Серологическая идентификация. Для сероди­агностики кампилобактерий выпускают агглютинирующие и лю-минесцирующие сыворотки против. С. fetus subsp. fetus (первый тип), С. fetus subsp. venerealis (второй тип), С. spulorum subsp. bubulus (третий тип).

Для ориентировочной идентификации выделенных культур ставят РА на стекле, используя указанные сыворотки, разведен­ные 1:50.

Для окончательной серологической идентификации кампило­бактерий ставят пробирочную РА. Для этого готовят последова­тельные разведения каждой из трех моноспецифических сыворо­ток в 3 %-м растворе хлорида натрия, содержащем 0,3 % формали­на, — 1 :25, 1 :50, 1 : 100, ! : 200. Затем в каждую пробирку с ука­занными разведениями моноспецифических сывороток добавляют по 0,5 мл исследуемой суспензии вибрионов концент­рацией 1 -10⁹. После внесения компонентов пробирки тшательно встряхивают и помещают в термостат (37 °С) до следующего дня. Затем их выдерживают 3...4 ч при комнатной температуре и учи­тывают результаты реакции.

При положительной реакции с моноспецифической сыворот­кой одного типа и отрицательной с моноспецифическими сыво­ротками остальных двух типов исследуемый штамм относят к тому типу, с которым получен положительный результат.

При получении положительной реакции с двумя моноспеци­фическими сыворотками (что может быть при выделении атипич­ных или диссоциированных штаммов) опыт повторяют с обеими моноспецифическими сыворотками, агглютинировавшими иссле­дуемую суспензию вибрионов, применяя более высокие разведе­ния, чтобы определить титр каждой сыворотки. Типовую принад­лежность исследуемого штамма устанавливают по той моноспеци­фической сыворотке, которая агглютинирует микробную суспен­зию в более высоком титре.

Для идентификации возбудителей кампилобактериоза в реак­ции иммунофлуоресценции используют как чистые, так и сме­шанные культуры, выращенные на общепринятых питательных средах.

Б и о и р о б а. Нативным материалом или выделенной культу­рой заражают беременных морских свинок внутрибрюшинно или во влагалище с последующим исследованием абортирован­ных плодов. Если в течение 10...12 сут аборт отсутствует, то мор­ских свинок убивают и исследуют содержимое полости матки и плоды. При необходимости биопробу ставят на беременных тел­ках и овцах, заражая их подкожно или перорально. Животные абортируют, а при отсутствии аборта их убивают с диагностичес­кой целью.

Серологическая диагностика. Основана у ко­ров на результатах реакции агглютинации с вагинальной слизью (РАВС), а у овец — РА с сывороткой крови.

Слизь берут марлевым тампоном, который помещают в про­бирку с 5 мл формалинизированного 3%-го раствора хлорида на­трия. Выдерживают 12...14 ч. Тампон отжимают, жидкость цент­рифугируют при 2500...3000 мин~' в течение 30 мин.

После центрифугирования реакцию ставят с экстрактом ваги­нальной слизи в четырех двукратных разведениях. Для приготов­ления кампилобактериозного антигена исходную концентриро­ванную суспензию бактерий разводят физиологическим раство­ром, содержащим 0,3 % формалина, в соотношении 1 : 10.

Наряду с исследуемыми пробами материала ставят контроли антигена: 1) контроль антигена (проверка самоагглютинации) — в пробирку наливают 0,5 мл антигена в рабочем разведении и добав­ляют 0,5 мл 3%-го формалинизированного раствора хлорида на­трия; 2) контроль активности антигена; в каждую пробирку с раз­веденной агглютинирующей кампилобактериозной сывороткой первого типа добавляют по 0,5 мл антигена; 3) контроль специ­фичности антигена: в две пробирки, содержащие по 0,5 мл нор­мальной сыворотки в разведениях 1: 100 и 1: 200, добавляют по 0,5 мл антигена. Все пробирки встряхивают и далее поступают с ними так же, как с опытными.

Вначале учитывают результаты контроля антигена. Отрица­тельная реакция в 1-м и 3-м контролях при положительной во 2-м свидетельствует о правильности постановки реакции.

Учет результатов: 1) положительная —реакция хорошо выра­жена (на три-четыре креста) во всех пробирках или только в 1-й и 2-й; 2) сомнительная —агглютинация на один-два креста в 1-й и во 2-й пробирках; 3) отрицательная — отсутствие агглютинации во всех пробирках.

У больных овец для исследования берут сыворотку крови, разводят ее в 100, 200 и 400 раз. Результат считают положитель­ным, если исследуемая сыворотка дает реакцию агглютинации в разведении 1 : 200 и выше на четыре или три креста, сомнитель­ным — на четыре или три креста в разведении 1 : 100 либо на два или один крест в разведении 1 : 200, отрицательным — если агглютинация отсутствует или ее оценивают не выше чем на два или один крест в разведении 1 : 100. Сыворотку овец, вакцини­рованных против кампилобактериоза, серологически не иссле­дуют.

Кроме РА сыворотку животных можно исследовать в РСК, ре­акции иммунофлуоресценции или реакции иммунной сорбции антител, меченных ферментами. Для выявления антител в РНГА разработаны экспериментальные партии диагностикумов, кото­рые используют для диагностики кампилобактериозов животных и человека.

Биопрепараты. И нактивиро ванная эмульсированная вакцина против кампилобактериоза овец.

Кампилобактериозные агглютинирующие сыворотки.

Кампилобактериозный антиген представляет собой инактиви-рованную 0,3%-м раствором формалина суспензию кампилобак-терий.

Возбудитель лептоспироза. Принадлежит к порядку Spirochaetales, семейству Spirochaetaceae, роду Leptospira. Патоген­ные лептоспиры составляют 25 серологических групп, включающих 124 серологических варианта, из них от сельскохозяйственных жи­вотных выделено семь— L. icterohaemotrfmgiae, L.pomona, L. tarassowi, L grippotyphosa, L. hebdomadis, L canicola, L. cazackstanika.

Лептоспироз — инфекционная болезнь разных видов животных и человека. Наиболее часто болезнь протекает с кратковременной лихорадкой в острой и подострой форме; гемоглобинурией {осо­бенно у телят), желтушностью слизистых оболочек. У коров и сви­номаток возможны аборты. Переболевшие животные длительное время остаются лептоспироносителями.

Бактериологическое исследование. В лабо­раторию направляют при жизни животного мочу, кровь в период лихорадки; посмертно — труп или кусочки паренхиматозных ор­ганов, почку, транссудат из грудной и брюшной полостей, пери-кардиальную жидкость, мочевой пузырь с содержимым, абортиро­ванный плод или органы плода. Жидкие субстраты отсасывают в стерильные пробирки. Патологический материал доставляют с на­рочным в опечатанном ящике не позднее 6 ч после гибели живот­ного в летнее время и 12 ч зимой. Воду (до 2 л) на наличие лептос-пир направляют в лабораторию в бутылях (колбах).

Из патологического материала готовят нативные неокрашен­ные препараты для микроскопирования методом «раздавленной капли» в темном поле зрения. Лептоспиры плохо воспринимают анилиновые краски. По Граму окрашиваются отрицательно, по методу Романовского — Гимза через 48 ч — в розово-фиолетовый цвет, по методу Киктенко — в красно-фиолетовый цвет (на бес­цветном фоне). Метод Киктенко заключается в том, что на не­фиксированный препарат наносят специальный раствор (0,2 г та­нина, 2 мл формалина, 5 мл 4 %-го спиртового раствора йода, 100 мл дистиллированной воды). Выдерживают 1 мин, сливают и наносят другой краситель (1 г генциан виол ета в 100 мл 25%-го этилового спирта) на 50 с при подогревании. После этого препа­рат промывают, высушивают и микроскоп и руют под иммерсией.

Морфология. Лептоспиры представляют собой тонкие длинные спиралеподобные микроорганизмы длиной 10... 15 мкм и шириной 0,1—0,2 мкм, количество спиралей (завитков) 10... 12 и более. Споры и капсулы не образуют. На концах лептоспир име­ются утолщения. Движение маятникообразное. Подвижность со­храняется не более 2 ч с момента взятия крови или мочи.

Выделение чистой культуры. Производят посе­вы патологического материала на полусинтетическую среду ГНКИ, состоящую из овечьего альбумина, воды и компалона (фактора роста), или на среды Любашенко и Терских, в основу которых взят фосфатно-буферный раствор на 5 % кроличьей сы­воротки и 1 % пептона, дистиллированная вода; рН среды 7,2...7,4. Лептоспиры — факультативные аэробы. Оптимальная температура роста культивирования 28...30 "С. Культивирование составляет 7...20сут. Среда остается прозрачной, рост культуры определяют микроскопированием препаратов из нее. Если макроскопически виден рост (помутнение среды и осадок) — культура загрязнена.

Патогенность. Определяют биопробой: выделенной культурой заражают морских свинок или золотистых хомяков, крольчат 3...5-недельного возраста. Культуру или взвесь исследуе­мого растертого материала инъецируют подкожно или внутрибрю-шинно хомякам в дозе до 1 мл, крольчатам — 2...3 мл (по два жи­вотных на каждую пробу). Одного убивают через 4...5 сут, второ­го—спустя 14...1бсут, вскрывают и проводят бактериологическое исследование.

Лептоспиры продуцируют ферменты (плазмокоагулазу, липазу и лецитиназу) и экзотоксины (гемотоксин, некротоксин), а также эндотоксин.

В культуре ткани лептоспиры проявляют цитопатогенное дей­ствие.

Серологические методы. Чаще используют для прижизненной диагностики лептоспироза. Кровь от животных допускается исследовать лишь через два месяца после их вакцина­ции. Самым распространенным методом является реакция микро-агглютинации (РМА) со свежей, высушенной на фильтровальной бумаге или консервированной 0,5 %-м раствором фенола сыво­роткой. Сначала готовят разведения сыворотки — 1: 50, 1:100, 1 : 200, 1: 400 (при необходимости и больше), затем добавляют ан­тиген — живые культуры лептоспир.

Удобно ставить реакцию в следующей модификации: из каж­дого разведения сыворотки (начиная с большего) по 0,1 мл вно­сят в 6...13 лунок пластины для серологических реакций или в пробирки Флоринского в зависимости от количества имеющихся в лаборатории антигенов — живых культур диагностических штаммов лептоспир. Каждый антиген — 5,..15-суточная культура лептоспир с концентрацией 70...100 микробных тел в поле зре­ния микроскопа (предварительная проверка) — вносят по 0,1 мл в четыре лунки (пробирки) с разными разведениями сыворотки по 0,1 мл. Электролитной средой служит 0,85 %-й раствор хлори­да натрия. Антигены с сывороткой встряхивают, помещают в термостат на 1 ч при 30 °С. Контрол — культура лептоспир с фи­зиологическим раствором (также по 0,1 мл). Используют иммунно-ферментный анализ.

Для учета реакции используют микроскопию: из каждой про­бирки (или лунки) готовят препарат «раздавленная капля» и мик-роскопируют его в темном поле микроскопа при увеличении 20 х 10. При наличии гомологичных антигену антител в сыворотке происходит агглютинация— образуются агглютинаты склеенных лептоспир в виде паучков или пучков, сохраняющих подвижность на свободных концах. Результат РМА оценивают в крестах: «++++» — агглютинация 100 % лептоспир, «+++» — 75 %, «++» — 50%, «+» — 25 % лептоспор; «—» — агглютинация отсутствует. В небольших разведениях сыворотки наблюдают набухание и непод­вижность, зернистость и лизис лептоспир. Положительная реак­ция признается с оценкой в четыре и три креста, два креста — ре­зультат сомнительный.

Помимо РМА ставят обычные РА, РСК и РИФ по общеприня­тым методикам.

Биопрепараты. Депонированная поливалентная вакци­на против лептоспироза сельскохозяйственных и промысловых животных: готовят из 7...10-суточной культуры лептоспир, кон­сервированных 5%-м раствором карболовой кислоты.

Поливалентная вакцина против лептоспироза сельскохозяй­ственных и промысловых животных: получают методом гиперим­мунизации волов-продуцентов. Антигены для гипериммунизации готовят из производственных штаммов 6 серогрупп.

Антигены для диагностики лептоспироза в реакции макроагг­лютинации: готовят из эталонных штаммов лептоспир. Выращен­ные культуры инактивируют формалином, концентрируют, рас­фасовывают по ампулам и подвергают сублимационному высуши­ванию.

Групповые агглютинирующие лептоспирозные сыворотки предназначены для определения серогрупповой принадлежности лептоспир, выделенных из патологического материала, а также лептоспир, используемых в качестве антигенов в реакции микро­агглютинации при серологической диагностике лептоспироза.

Возбудитель дизентерии свиней (Serpulina hyodysenteriae). При­надлежит к роду Serpulina.

Бактериологическое исследование. Включа­ет в себя обнаружение возбудителя в исходном материале методом световой микроскопии, а также выделение чистой культуры посе­вом на питательные среды и идентификацию возбудителя по куль-турально-морфологическим и ферментативным свойствам.

Для прижизненной диагностики в лабораторию направляют фекалии, для посмертной — слизистую оболочку большой ободоч­ной кишки, которую соскабливают после удаления из кишечника содержимого и промывания водой. От трупов материал берут не позднее чем через 2 ч после гибели животного: материал должен быть исследован в течение 2...4 ч, а при хранении на холоде — 6...8ч.

Микроскопия. Поскольку культивирование возбудителя весьма трудоемко, микроскопическое исследование — это основ­ной метод диагностики, доступный практическим лабораториям. Поступивший материал исследуют методом темнопольной, фазо-во-контрастной или обычной световой микроскопии.

При темнопольной микроскопии препарат «раздавленная кап­ля» исследуют в водной иммерсии с объективом х 40 и окулярами х7 или х 10. Возбудитель в этом случае виден как спиралевидная клетка с 3...I2 правильными витками размером (7...9) х х (0,3...0,4) мкм, движущаяся змеевидно-поступательно. При тем­пературе 22 °С наблюдают изгибание клетки и скользящее движе­ние, а при 37...42 °С —поступательное. У большинства больных дизентерией свиней в препарате «раздавленная капля» в одном поле зрения обнаруживают 5... 10 спирохет и более. В препаратах, окрашенных по Граму, видны грамотрицательные извитые клетки со строением, типичным для спирохет. Клетки возбудителя хоро­шо окрашиваются по Романовскому—Гимза, фуксином Пфейф-фера. Сходные по морфологии с Serpulina hyodysenteriae вибрионы, обитающие в кишечнике, отличаются тем, что толщина их клетки в 2...4 раза больше, с тупыми концами, движение вращательное вокруг длинной оси.

Культурально-биохимические свойства. Возбудитель —строгий анаэроб. Температурный оптимум роста 36...38°С (при 25...30°С не растет), рН 7,0...7,2. Для первичного выделения используют селективные среды. Например, кровяной агар со спектомицином готовят следующим образом: к перевару Хоттингера добавляют 0,001 % резазурина, 0,5 % хлорида натрия, 0,25 % глюкозы, 1 % пептона, 2 % агара, кипятят, через среду про­пускают азот или диоксид углерода в течение 10...15 мин, устанав­ливают рН 7,0...7,2, вносят 0,05 % гидрохлорида цистеина. Среду автоклавируют при 110°С в течение 30 мин, охлаждают до 40...45 "С, пропуская при этом через среду стерильный газ без кис­лорода, после чего вносят 10 % дефибринированной крови барана (или крупного рогатого скота) и 400 мкг/мл спектомицина. Среду разливают в атмосфере оксида углерода. На кровяном агаре через 48...96 ч инкубирования при 38 °С вырастают плоские просвечива­ющие колонии диаметром 0,5...3 мм с зоной р-гемолиза.

Культивируют также в жидкой или полужидкой среде, содер­жащей сердечно-мозговую вытяжку и 10 % эмбриональной теля­чьей или кроличьей сыворотки. На кровяном агаре через 48—96 ч инкубирования при 38 °С вырастают плоские просвечивающие ко­лонии диаметром 0,5...3мм с зоной р-гемолиза. В полужидком сывороточном агаре возбудитель растет в виде беловатого диффуз­ного облачка ближе к поверхности среды.

После изучения морфологических и культуральных свойств у выделенных бактерий исследуют ферментативную активность. Патогенные для свиней культуры гидролизуют эскулин, не ферментируют фруктозу, утилизируют пируват. При сбраживании глюкозы образуют водород, диоксид углерода, ацетат; нитраты не восстанавливают; растут на средах, содержащих 6,5 % хлорида на­трия, но не растут на средах с 1 % глицина.