Тема 12. Биологические препараты и их контроль

Вакцины. Эти биологические препараты содержат в качестве активного начала цельные микробные клетки или их компоненты. Вакцины предназначены для создания искусственного активного иммунитета. Различают несколько основных типов вакцин против инфекционных болезней сельскохозяйственных животных.

Контроль вакцин. Вакцины всех типов после приго­товления проверяют в основном по трем параметрам.

Стерильность (инактивированные) или чистоту роста (живые) контролируют посевом на питательные среды.

Безвредность проверяют введением вакцины тем или иным ла­бораторным животным. Вакцина не должна вызывать заболевание и гибель животных.

Активность (иммуногенность) обычно контролируют следую­щим образом. Вакцину вводят лабораторным животным, и через промежуток времени, достаточный для выработки активного им­мунитета (15...20сут), эту группу вместе с контрольной группой непривитых животных заражают летальной дозой возбудителя. 80 % и более контрольных животных должны погибнуть, вакцини­рованные должны выжить. В некоторых случаях об иммуногенно-сти препарата судят по косвенным показателям: количеству аг­глютининов у привитых животных (лептоспирозная вакцина), ан­титоксинов в РН (вакцина против ботулизма).

Например, сухую живую вакцину против рожи свиней ВГНКИ из штамма ВР-2 контролируют следующим образом. Для контроля чистоты сухую (лиофилизированную) вакцину разводят стериль­ным физиологическим раствором в соотношении I : 10. Из сус­пензии бактерий готовят мазки, красят по Граму, микроскопиру-ют. В препарате должны быть типичные мелкие грамположитель­ные палочковидные клетки при отсутствии посторонних микро­организмов. Одновременно проводят посевы на МПА, МПБ, среду Китта—Тароцци и агар Сабуро. Посевы выдерживают 10 сут при 37...38 °С, посевы на грибы — 15 сут при 20...25 °С. Рост посто­ронней микрофлоры в указанные сроки на всех питательных сре­дах должен отсутствовать при наличии типичного роста на МПА и МПБ культуры возбудителя рожи.

С целью контроля вакцины на безвредность и активность 20 белым мышам массой 17... 18 г вводят подкожно 0,2 мл препарата. Вакцину считают безвредной, если погибает не более 5 мышей. Через 14 сут всех оставшихся в живых вакцинированных и пять контрольных мышей заражают летальной дозой культурой виру­лентного штамма возбудителя рожи свиней. Вакцину признают активной, если погибают в течение 3...4 сут контрольные и выжи­вает не менее 75 % вакцинированных мышей.

Лечебно-профилактические иммунные сыворотки и иммуноглобу­лины. Данные биопрепараты применяют для создания пассивного иммунитета при профилактике или лечении. Под пассивной им­мунизацией понимают введение готовых иммуноглобулинов (ан­тител) животному. Пассивный иммунитет возникает через 20...24 ч после инъекции и длится максимум 2...3 нед. Иммунные сыворотки получают путем многократного введения антигена жи­вотным-продуцентам (волам, лошадям и др.). Для получения каж­дого типа иммунных сывороток разработаны регламенты приго­товления соответствующего антигена, схемы иммунизации и ме­тоды, с помощью которых контролируют количество антител в сыворотке крови.

По направленности действия иммунные сыворотки подразде­ляют на антибактериальные, антитоксические, антивирусные. По достижении необходимого уровня антител у животного берут кровь обычно в объеме 1 % массы животного или осуществляют тотальное обескровливание. Полученную кровь сепарируют для получения сыворотки, которую стерилизуют фильтрованием и

консервируют 0,25...0,5%-м фенолом, 0,01...0,03%-м тиомерсалом или другими веществами.

Контроль сывороточных препаратов. Включает в себя проверку на стерильность, безвредность и специ­фическую активность.

Стерильность препаратов определяют посевом на питательные среды (МПА, МПБ, МППБ, агар Сабуро или Чапека). Безвред­ность каждой серии обычно контролируют введением сыворотки морским свинкам. Специфическую активность сыворотки прове­ряют в зависимости от направленности ее действия.

Определение превентивных (защитных) свойств на есте­ственно-восприимчивых или лабораторных животных заключа­ется и в том, что животным вводят подкожно, внутримышечно или внутрибрюшинно сыворотку, а через 20...24 ч иммунизиро­ванным и контрольным животным вводят подтитрованную дозу гомологичного вирулентного микроорганизма. Иммунизиро­ванные животные должны остаться здоровыми. Контрольные переболевают с проявлением характерных признаков заболева­ния.

Активность антитоксических и ряда противовирусных сыворо­ток определяют в реакциях нейтрализации (РН). Количество ан­тител в сыворотках устанавливают при помощи серологических реакций (РСК, РА, РИГА, РДП и др.).

Пример. Контроль иммунной сыворотки против рожи свиней.

Контроль стерильности: сыворотку высевают на МПА, МПБ, МППБ, агар Сабуро. Посевы выдерживают Юсут при 37 и 20 °С (Сабуро). Среды должны остаться стерильными.

Контроль безвредности: 5 белым мышам массой 17...20 г вводят подкожно по 0,5 мл сыворотки, 2 морским свинкам массой 250...300 г —по 10 мл. Все привитые животные должны остаться живыми в течение 10 сут.

Контроль активности: 15 белым мышам массой 17...20 г вводят внутрибрюшинно по 0,01, 0,02 и 0,03 мл (по 5 мышей на дозу) сы­воротки. Через 2 ч всем привитым и 5 мышам непривитым вводят подкожно 0,1...0,2 мл суточной культуры вирулентного штамма возбудителя рожи свиней, разведенной 1 : 200. Сыворотку считают активной, если в течение 10 сут все привитые животные остаются живыми, а контрольные погибают (допускается гибель 2 белых мышей, привитых дозой 0,01 мл).

Для концентрирования антител иммунной сыворотки, удале­ния серологически неактивных белков и соответственно повыше­ния специфической активности препарата применяют методы, с помощью которых выделяют глобулиновую фракцию белков им­мунной сыворотки. Готовые препараты иммуноглобулинов конт­ролируют, как и иммунные сыворотки: на стерильность, безвред­ность и специфическую активность.

Диагностические антитела. Принцип получения диагностичес­ких иммунных сывороток такой же, как и лечебно-профилакти­ческих. Диагностические сыворотки должны обладать не только высокой активностью в серологических реакциях, но и специфич­ностью. С помощью диагностических сывороток обнаруживают микробные антигены в тканевых материалах и идентифицируют выделенные микроорганизмы. В зависимости от целевого назна­чения различают видовые сыворотки (предназначены для иденти­фикации микроорганизмов на уровне вида), групповые (иденти­фикация на уровне серологической группы), серовариантные (на уровне серовара). Иммунные сыворотки готовят для использова­ния в различных серологических реакциях (РА, РП, РДП, РСК, РИГА, РН). При получении антител, меченных флуорохромом и ферментами, из иммунных сывороток предварительно выделяют и очищают иммуноглобулиновую фракцию. В основном диагности­ческие сыворотки (диагностикумы) контролируют на стериль­ность, активность и специфичность.

Пример. Контроль диагностической сыворотки люминес-цируюшей сальмонеллезной.

Определение активности (красящий титр): из 24-часовых ага­ровых гомологичных культур сальмонелл готовят мазки (негус­тые), фиксируют их, затем на каждый мазок наносят различные разведения флуоресцирующей сыворотки. В дальнейшем препара­ты обрабатывают, как описано ранее.

Мазки просматривают под люминесцентным микроскопом. Максимальное разведение сыворотки обеспечивает свечение го­мологичных микробных клеток на 3...4 креста. Ее считают крася­щим титром, если рабочий титр, т. е. используемый в работе, ра­вен половине красящего. Красящий титр для групповых сыворо­ток должен быть не ниже 1: 32, для комплексной —1:16.

Контроль специфичности люминесцирующей сыворотки: ана­логичным образом на предметных стеклах готовят мазки из гете-рологичных сальмонелл и эшерихий (по нескольку культур)- Флу­оресцирующую сыворотку используют в рабочем титре. Свечение у гетерологичных микробов практически должно отсутствовать.

Получение моноклональных антител. Обычные иммунные диагностические сыворотки, выпускаемые биофабриками, представляют собой смесь антител против различ­ных антигенных детерминант возбудителя инфекционной болез­ни. Использование таких сывороток для идентификации возбуди­теля сопряжено с получением перекрестных реакций между серо-варами одного вида и даже между различными видами микроорга­низмов за счет общих антигенных детерминант. Избежать таких нежелательных перекрестных реакций пытаются различными спо­собами. Один из методов заключается в использовании в качестве антигенов для иммунизации животных-продуцентов компонентов клеток возбудителя, несущих преимущественно специфические

антигены. Часто такие вещества получают, разделяя антигенную смесь фильтрованием через сефадексы.

Другое традиционное направление в получении специфичес­ких реагентов — метод адсорбции иммунных сывороток, когда пе­рекрестно реагирующие антитела удаляют, насыщая сыворотку клетками антиген но-родственных бактерий. Клетки бактерий свя­зывают перекрестнореагирующие антитела, и потом их вместе с антителами отделяют от адсорбированной сыворотки центрифу­гированием. Подобным образом получают адсорбированные агг­лютинирующие сыворотки для идентификации сальмонелл и не­которых других видов бактерий.

В качестве специфических антительных реагентов все чаще ис­пользуют моноклональные антитела. Обычные диагностические сыворотки — поликлопальные, поскольку содержат антитела, синтезированные разными линиями (клонами) В-лимфоцитов к различным антигенным детерминантам. Моноклональные антите­ла представляют собой иммуноглобулины, продуцируемые одним клоном клеток и реагирующие с определенным антигенным эпитопом микроорганизма.

Чтобы получить моноклональные антитела, изолируют и под­держивают линию лимфоцитов, синтезирующих антитела опреде­ленной специфической направленности. Клетки-продуценты анти­тел не способны расти in vitro. Злокачественная опухоль (миелома) синтезирует в больших количествах аномальные иммуноглобулины и способна к неограниченному росту in vitro. Была разработана ме­тодика слияния клеток миеломы с лимфоцитами, при этом гибрид­ная клетка (гибридома), как и опухолевая, способна к неограничен­ному росту и одновременно синтезирует антитела, как лимфоид-ная. Необходимо обнаружить клон клеток, продуцирующих антите­ла необходимой специфической направленности. Получение моноклональных антител включает в себя несколько этапов.

Известным антигеном иммунизируют животных. Затем из се­лезенки выделяют В-лимфоциты.

Проводят слияние (гибридизацию) В-лимфоцитов и миелом-ных клеток. Получают смесь лимфоцитов гибридных и миелом-ных клеток.

Смесь клеток культивируют в среде, содержащей ГАТ (гипок-сантин — аминоптерин — тимидин), что приводит к гибели лим­фоцитов и миеломных клеток, так как на этой среде растут только гибридомы.

Гибридомные клетки рассевают (клонируют) таким образом, чтобы в лунке панели для микрокультивирования оказалась толь­ко одна клетка, дающая начало клону. После размножения клеток оценивают их способность синтезировать нужные антитела (про­водят скрининг). Клонирование повторяют. В конечном итоге вы­бирают стабильный клон, продуцирующий антитела заданной специфичности.

Клетки гибридомы можно длительно хранить в замороженном состоянии (в жидком азоте).

Моноклональные антитела выделяют либо из культуральной жидкости (клетки гибридомы выращивают in vitro), либо из асци-тической (выращивание in vivo).

Моноклональные антитела используют для диагностики ин­фекционных болезней в иммуноферментном, радиоиммунном и иммунофлуоресцентном анализах.

Диагностические антигены. Предназначены для постановки раз­личных серологических реакций с целью серодиагностики инфек­ционных болезней животных. В зависимости от типа серологичес­кой реакции антигены могут быть корпускулярными (РА, РСК), на носителях (эритроцитарные антигенные диагностикумы для РИГА), растворимые (РП, РДП). Технология приготовления ан­тигенов разнообразна, но основой для антигенов любого типа слу­жат исходные селекционированные, без признаков диссоциации культуры микроорганизмов.

Контроль диагностических антигенов проводят по определен­ным параметрам:

контроль стерильности (см. вакцины);

антиген для серологических реакций должен быть определен­ной оптимальной концентрации, выраженной, например, числом микробных клеток в I мл;

активность антигена определяют в той или иной серологичес­кой реакции с заведомо положительной сывороткой. Антиген дол­жен давать четкую положительную реакцию. В некоторых случаях сначала устанавливают предельный титр антигена — разведение, в котором он дает положительную реакцию с наибольшим разведе­нием стандартной положительной сыворотки. Для постановки се­рологической реакции при диагностических исследованиях ис­пользуют рабочий титр антигена—двойную дозу предельного титра (единый бруцеллезный антиген);

специфичность антигена испытывают в серологической реак­ции с заведомо отрицательной сывороткой.

Корпускулярные антигены для серологических реакций оса­дочного типа контролируют на спонтанную агглютинацию — вы­падение в осадок в отсутствие антител.

Пример. Контроль диагностического бруцеллезного анти­гена для кольцевой реакции с молоком. Используют клетки бру-целл стандартной концентрации, окрашенные гематоксилином.

Контроль стерильности (см. контроль вакцин). Контроль специ­фичности и активности. Берут 10 проб свежего молока от здоро­вых коров. Молоко каждой пробы исследуют с разными количе­ствами положительной бруцеллезной сыворотки. Антиген призна­ют специфичным, если во всех пробирках, в которые не добавляли положительную сыворотку, получен отрицательный результат — молоко окрашено, заметно белое кольцо отстоявшихся сливок.

Антиген признают активным, когда во всех трех пробирках каж­дой пробы с позитивной сывороткой или в пробирках с 0,15 и 0,1 мл сыворотки получен четкий положительный результат —мо­локо белое, слой сливок синего цвета.

Диагностические аллергены. Данные биопрепараты (бруцеллин, туберкулин, маллеин) представляют собой экстракты из клеток возбудителя и содержат продукты их метаболизма. Аллергическая диагностика основана на выявлении гиперчувствительности за­медленного типа, которая развивается при ряде инфекционных болезней, особенно хронических. В основе этих диагностических тестов лежит специфическая реакция иммунного воспаления с участием сенсибилизированных Т-лимфоцитов.

Пример. Контроль диагностических аллергенов бруцелли-на, предназначенного для диагностики бруцеллеза,

Контроль стерильности {см. контроль вакцин).

Контроль безвредности: бруцеллин в объеме 0,5 мл вводят в об­ласть спины белым мышам массой 18...25 г. В течение Юсут мыши должны остаться живыми: воспалительная реакция на мес­те инъекции отсутствует.

Контроль специфичности: белым морским свинкам в депилиро-ванный участок боковой поверхности туловища внутрикожно вво­дят бруцеллин в объеме 0,1 мл и сравнивают с эталонным препа­ратом. При учете результатов через 24 и 48 ч на месте инъекции не должно быть аллергической реакции. Кроме того, здоровым 10 ов­цам бруцеллин вводят под кожу нижнего века по 0,5 мл (пальпеб-рально) и внутрикожно в подхвостовую складку по 0,2 мл. Конт­ролем также служит эталонный аллерген. Аллерген считают спе­цифичным, если у здоровых животных аллергических реакций не возникает. Кроме того, проверяют аллерген на антигенные свой­ства. Для этого у овец через 10...15сут после введения аллергена исследуют в РА и РСК сыворотку крови — антител не должно быть.

Контроль активности; 10...15 белым морским свинкам вводят подкожно (0,25...1)10⁹ клеток штамма В. melitensis Rev 1 для аллер­гической сенсибилизации. Через 4нед в депилированный участок кожи вводят 0,1 мл исследуемого бруцеллина и в качестве контро­ля эталонный аллерген. Реакцию учитывают через 24 ч, измеряя диаметр эритем (отека).

Интенсивность реакции на исследуемый и эталонный аллерге­ны должна быть одинаковой.

ВОЗБУДИТЕЛИ ИНФЕКЦИОННЫХ БОЛЕЗНЕЙ