Темнопольный конденсор.

При темнопольной микроскопии используют специальный конденсор с затемненной центральной частью, поэтому в плоскость объекта попадают толь­ко боковые лучи, отраженные от внутренних зеркальных поверх­ностей конденсора. Лучи направлены под таким углом, что не по­падают в линзу объектива, и поэтому поле зрения выглядит тем­ным (см. рис. 8). Та часть лучей, которая попадает на объект, отра­жается в линзу объектива, что позволяет видеть светлое изображение объекта на темном фоне.

Метод темнопольной микроскопии:

1. Вынимают окуляр, светлопольный конденсор и вывинчивают один из объективов (х8).

2. Прикрывают диафрагму осветителя и фокусируют нить накала лампы осветителя на листе белой бумаги, помещенном на зеркало (см. п. 5 установки освещения по Келеру).

3. Раскрывают диафрагму осветителя, закрывают матовым стеклом конец тубуса и с помощью зеркала добиваются равномерого освещения поля зрения.

4. Ставят на место окуляр, объектив х8, темнопольный конденсор, положение зеркала при этом не изменяют.

5. На линзу конденсора наносят каплю дистиллированной воды, на столик помещают препарат «раздавленная капля» таким образом, чтобы вода на линзе конденсора контактировала с нижней поверхностью предметного стекла.

6. Глядя в окуляр, при помощи центрировочных винтов переводят в центр поля зрения светлое кольцо с темным пятном в центре. Далее регулируют видимость объекта в поле зрения.

Люминесцентная микроскопия.

Люминесценцией (lumen — свет, escent — слабое действие) называется свечение объекта, возбуждае­мое поглощенной им световой энергией. Возбуждать люминесцен­цию можно как ультрафиолетовым излучением, так и коротковол­новым излучением видимой части спектра — сине-фиолетовым. При этом может возникать люминесценция в цветовой гамме види­мого спектра, что дает цветное светящееся изображение. Если объект сам не дает явления люминесценции, его подкрашивают специальными красителями — флуорохромами (акридин оранже­вый, корифосфин, тиофлавин и др.).

Установка для люминесцентной микроскопии в видимых лучах состоит из яркого источника света и биологического микроскопа (рис. 9). Непосредственно между источником света и зеркалом микроскопа устанавливают сине-фиолетовый светофильтр, а на окуляр микроскопа — желтый светофильтр. Сине-фиолетовый свет, попав на препарат, возбуждает в последнем люминесцен­цию. Для того чтобы ее увидеть, необходимо убрать все сине-фиолетовые лучи, что и осуществляет желтый фильтр на окуляре, от­секающий коротковолновую часть спектра и пропускающий в глаз наблюдателя длинноволновый свет флуоресценции.

Ветеринарно-бактериологические лаборатории снабжены лю­минесцентными микроскопами серий МЛ и «Люмам» (Р-1, Р-2, Р-3 — модели рабочего типа; И-1, И-2, И-3 — модели исследова­тельского типа).

Атомы некоторых веществ, называемых люминофорами (люми-ногены, флуорохромы), поглощая энергию, переходят на более высокий энергетический уровень (возбуждаются). Возбужденное состояние слабоустойчивое, атомы возвращаются на стабильный низкоэнергетический уровень, отдавая избыток энергии в виде свечения — люминесценции. В зависимости от источника энергии возбуждения различают фото-, электро-, радио-, хемо- и рентге-нолюми несценцию.

В лабораторной практике в основном используют фотолюми­несценцию — свечение, возбуждаемое энергией световых лучей. По длительности свечения различают люминесценцию кратковре­менную — флуоресценцию, быстро затухающую после прекращения воздействия возбуждающих лучей, и длительную — фосфоресцен­цию, продолжающуюся и после окончания возбуждения вещества. По правилу Стокса свет флуоресценции отличается от света воз­буждения большей длиной волны, поэтому при освещении объек­та невидимыми ультрафиолетовыми или короткими сине-фиоле­товыми лучами получают длинноволновые свечения объектов, хо­рошо видимые простым глазом.

Различают первичную и вторичную люминесценцию. Первич­ная люминесценция присуща практически всем веществам, однако интенсивность свечения большинства из них невелика. Флуорох-ромы, связываясь с определенными химическими структурами клетки, придают им способность ярко люминесцировать при ос­вещении объекта (препарата) сине-фиолетовыми лучами — вто­ричная люминесценция.

В люминесцентных микроскопах источником возбуждения служит ртутно-кварцевая лампа ДРТ-250. Для успешной люми­несцентной микроскопии необходимо: 1) из светового потока, идущего от ртутно-кварцевой лампы, с помощью специальных светофильтров выделить коротковолновую (сине-фиолетовую) часть спектра для возбуждения свечения изучаемого объекта и от­сечь лучи той же длины, что и лучи люминесценции (в противном случае все поле зрения будет интенсивно светиться). Для этого между источником света и исследуемым объектом ставят свето­фильтры (возбуждающие) УФС-3, ФС-1, СС-4 и др.; 2) из свето-воТо потока, идущего от изучаемого объекта в окуляр, пропустить длинноволновое свечение (люминесценцию) и одновременно за­щитить глаз наблюдателя от коротковолновых (возбуждающих) лучей. С этой целью между объектом и глазом наблюдателя по­мешают окулярные (запирающие) светофильтры: ЖС-3, ЖС-18, Т-1НиТ-2Н.

Сочетанное применение в оптической системе люминесцентного микроскола фильтров целевого назначения (возбуждающие, запира­ющие) называют принципом скрещенных фильтров. Эффект скрещен­ных светофильтров обеспечивает цветную (зелено-желтую) флуорес­ценцию объектов на темном фоне поля зрения. Ход лучей в люми­несцентном микроскопе показан на рисунке 9. Лучи от лампы ДРТ попадают на светоделительную пластинку между объективом и оку­ляром. Ненужные длинноволновые лучи проходят через светодели­тельную пластинку и гаснут в кожухе микроскопа. Возбуждающие коротковолновые лучи пластинка отражает на изучаемый объект. Часть возбуждающих лучей трансформируется на объекте в длинно­волновые лучи люминесценции, которые проходят через объектив, светоделительную пластинку, запирающие фильтры и попадают в глаз наблюдателя. Другую часть возбуждающих лучей, не претерпев­ших изменений, светоделительная пластинка отражает в сторону ис­точника света. Такое дифференцирующее свойство светоделитель-ной пластинки обусловлено тем, что она покрыта несколькими слоя­ми диэлектриков и расположена под углом 45° по отношению к па­дающим на нее лучам.

Существенное отличие микроскопов серии «Люам» т МЛ — наличие у «Люмам» сменных светоделительных пластин с разны­ми параметрами возбуждающего спектра и спектра люминесцен­ции, комбинируемых с соответствующими запирающими фильт­рами и фильтрами возбуждающего света. При люминесцентной мик­роскопии в качестве иммерси­онной жидкости используют специальное нефлуоресцирую-щее масло (обычное иммерси­онное масло для этих целей не­пригодно из-за собственной люминесценции).

Преимущество люминесцентной микроскопии заклю­чается В ТОМ, ЧТО она дает цветное изображение, высокую сте-пень контрастности, возможность обнаруживать в исследуемом материале бактерии в небольших количествах (цв. рис. I; рис.10). В микробиологии нашли применение такие виды исследований, как люминесцентная микроскопия флюорохромированных объектов и метод флуоресциру-ющих-антител (МФА) в экспресс-диагностике инфекционных болезней.

Люминесцентная микроскопия позволяет обнаружить ряд важ­ных клеточных структур, изучить их изменения при разных функ­циональных состояниях организма, различать мертвые и живые клетки, облегчает количественный подсчет микроорганизмов.

Для люминесцентной микроскопии применяют осветитель ОИ-18 с ртутно-кварцевой лампой РК или СВДШ-120А в комби­нации с обычными биологическими микроскопами, или специ­альный люминесцентный микроскоп МЛ-2.

Рис.10 Вид препарата в люминесцентном микроскопе.

Рис. 11. Схема электронного микроскопа:

/ — к вакууму; 2— вакуумная трубка; J—к ис­точнику питания нити накала; 4— нить (катод); 5—анод; 6 — заземление; 7— электронный луч; 8— конденсорная линза; 9— объект; 10— объек­тивная линза; 11 — увеличенное изображение объекта; 12 — проекционная линза; 13 — люми­несцентный экран; 14 — фотографическая плас­тинка; /5— к источнику питания линз. То­чечной линией изображен ход электрон­ных лучей