Определение патогенности.

Патогенность микроорганизма, вы­деленного при исследовании патологического материала, опреде­ляют с помощью биологической пробы (биопробы), т. е. зараже­нием лабораторных животных: белых мышей и крыс, морских свинок, кроликов, голубей, кошек, а также собак (чаще щенков), кур, мелкого и крупного рогатого скота (телят), обезьян, лошадей и др. Выбор вида животного для биопробы основывается на его восприимчивости к исследуемому объекту. Для биопробы берут не только выделенную микробную культуру, но и непосредственно патологический материал, из которого для этой цели готовят взвесь растертой в стерильной ступке ткани органов, гной, слизь, разбавленные физиологическим раствором. Биологическая проба необходима также при установлении безвредности биологических препаратов (вакцин, сывороток).

Помещение для содержания лабораторных животных (вива­рий) должно иметь несколько отделений: карантинное, клиничес­кое для выполнения определенных работ (взятие крови, зараже­ние, вскрытие и др.), кладовую, кухню и др. Перед заражением животных метят: кроликов и морских свинок — металлическими сережками с номерами, белых мышей и крыс — раствором краски (фуксина, метиленовой сини и др.) (рис. 39).

Для удобства и безопас­ности работы животных фиксируют (рис. 40 и 41). Морских свинок помощник держит брюшком вверх так, чтобы средний палец левой руки находился на шее, а большой и 'указательный — под передними конечнос­тями, правой рукой при­

_{Рис 39.} ключ к мечению зараженных животных

держивают задние конечно­сти. Мышь берут одной ру­кой за кончик хвоста, дру­гой — за кожную складку затылка, ближе к ушам, и повертывают в удобное для манипуляции положение.

Крыс фиксируют корнцан гами, захватив складку

Рис. 40. Фиксация и заражение мышей

Рис. 41. Фиксация и заражение морских свинок

кожи затылка, плотно прижимают голову к поверхности стола, другой рукой держат за хвост и поворачивают в удобное положе­ние, оттягивая корнцангом голову.

Животных заражают следующими методами: накожным (ска­рификация), внутрикожным, подкожным, внутримышечным, внутривенным, внутрибрюшинным, оральным, интраназальным, интрацеребральным и в переднюю камеру глаза. Используемые при этом инструменты (шприцы, иглы и др.) должны быть сте­рильными.

При скарификации скальпелем делают небольшой надрез кожи — насечку и в нее апплицируют исследуемый матери­ал или бактериальную культуру. Испытуемый материал можно также втирать жесткой щеточкой. Место заражения выстригают и дезинфицируют.

При внутрикожном способе пальцами левой руки от­тягивают кожу и в образующуюся между ними кожную складку вводят кончик иглы. Вводимая доза материала не должна превы­шать 0,2 мл. Показатель правильного введения — небольшая при­пухлость величиной с горошину.

При подкожном инфицировании пальцами левой руки оттягивают кожу; у кроликов — со стороны спины несколько сбо­ку, у белых мышей и крыс — со спины ближе к основанию хвоста. В образовавшийся «кармашек»-складку вводят иглу шприца, затем его содержимое. Объем вводимого вещества не должен превышать для мышей 1 мл, для крыс, морских свинок— 10 мл, кроликов — 20...25 мл.

При внутримышечном заражении инъецируемый ма­териал чаше вводят с внутренней поверхности бедра. Голубей и

кур можно заражать также и в грудную мышцу. Доза введения мышам составляет 0,5 мл, морским свинкам и крысам — 3...5 мл, кроликам — 5...8 мл. Большой объем лучше вводить дробно в 2...3 места.

При внутрибрюши ином заражении животное фик­сируют головой вниз, иглу шприца вводят в нижнюю треть живо­та, чуть отступя от белой линии.

Внутривенно исследуемый материал кроликам вводят в краевую вену уха, мышам и крысам — в вену хвоста. Перед зара­жением место инъекции протирают тампоном, смоченным ксило­лом или теплой водой, чтобы вызвать наполнение сосудов кровью.

При интрацеребральном заражении животных фиксируют в спинном положении. У кроликов для этой цели тре­панируют череп в участке между надбровным углом и черепным гребнем. Поле операции выстригают, дезинфицируют, пальцами левой руки растягивают кожу над глазницей параллельно череп­ному гребню и рассекают ее (раздвигают ее края), крестообразно разрезают надкостницу, маленьким трепаном прокалывают череп­ную кость и извлекают небольшой кусочек ее; из шприца вводят 0,2 мл исследуемого материала. После этого соединяют края над­костницы, края кожной раны заливают коллодием.

У мышей и крыс трепанацию не делают, а легким проколом костной ткани вводят кончик иглы и инъецируют материал.

Интраназально заражение осуществляют капельным способом, используя глазную пипетку. Предварительно животное слегка наркотизируют — к носу прикладывают вату, смоченную эфиром.

При оральном заражении исследуемый материал добав­ляют в корм, воду или вводят через небольшой зонд.

В случае гибели зараженного животного труп вскрывают, со­блюдая правила асептики, и производят бактериологическое ис­следование.

Для вскрытия труп фиксируют в спинном положении (брюш­ком вверх) на деревянной доске или лотке с застывшим парафи­ном; конечности растягивают и закрепляют мелкими гвоздиками. Кожно-шерстный покров дезинфицируют 5%-м раствором фено­ла или лизола. Разрезают кожу вдоль белой линии от промежности до грудино-ключичного сочленения, а затем делают поперечные надрезы (рис. 42). Отпрепарированные кожные лоскуты отводят в сторону. Так же надрезают брюшину, вскрывают брюшную по­лость, подрезают ребра, диафрагму, вскрывают грудную полость. При вскрытии обращают внимание на патологоанатомическую картину.

После этого прижигают поверхность сердца, печени, почки и других органов, пипеткой прокалывают нужный участок, насасы­вают небольшое количество крови и высевают ее на питательные среды, соблюдая стерильность. Если в органах имеются очаги поражения, то из них пастеровской пипеткой также производят по­сев на питательные среды. Наряду с посевами готовят и препара­ты-отпечатки из тканей органов: отрезают кусочек печени, селе­зенки, почки, лимфатических узлов и к поверхности разреза при­кладывают предметное стекло; препарат высушивают, фиксируют, окрашивают и микроскоп ируют.

После окончания работы трупы утилизируют: помещают в ме­таллические бачки, заливают хлорноизвестковым молоком или 5...10%-м раствором хлорной взвеси, затем сжигают.

Вирулентность (токсигенность) микроба изме­ряют в специальных условных единицах: абсолютная летальная доза {Del — dosis certae letalis) вызывает гибель 100 % зараженных животных; 50%-я летальная доза (LD50) — 50 % зараженных жи­вотных; 50%-я инфицирующая доза (Ш₅₀) вызывает заболевание у 50 % зараженных животных. LD₅q и Ш₅о — наиболее точные пока­затели, поскольку отражают чувствительность к возбудителю (ток­сину) большинства взятых в опыт животных, a Del показывает чувствительность наиболее устойчивых особей.

Для расчета LD50 исследуемой культуры микроорганизма используют один из приведенных методов. Готовят суспензию бактерий с известным содержанием микробных клеток в едини­це объема. Затем делают последовательные (2, 5, 10-кратные) разведения суспензии на стерильном физиологическом раство­ре и равные объемы каждого разведения вводят (подкожно, внутрибрюшинно и т. д.) чувствительным лабораторным живот­ным. Если определяют летальный эффект, то учитывают число погибших животных и рассчитывают LD₅o ■ Поскольку обычно ни одна из доз возбудителя не приводит к гибели строго 50 % зараженных животных, то LD₅o определяют статистическими методами.

Тест на плазмокоагулазу. Коагулаза — фермент бактерий (стафилококков), который в сочетании с некоторыми компонентами сыворотки коагулирует плазму. Благодаря коагула-зе вокруг стафилококковых поражений образуется фибринозный барьер, облегчающий персистенцию бактерий в тканях, кроме того, отложения фибрина на поверхности бактериальных клеток затрудняют их фагоцитоз.

Бактериальную массу исследуемой культуры, снятой петлей с поверхности агаровой среды, смешивают с 0,5 мл плазмы крови кролика (человека), не разведенной или разведенной стерильным физиологическим раствором в соотношении 1: 4, инкубируют при 37 °С; результаты учитывают через 4 и 24 ч. Положительная реак­ция — образование сгустка.

Тест на гиалуронидазу. Гиалуронидаза — фермент, расщепляющий гиалуроновую кислоту и, как следствие, деполиме-ризуюший межклеточное вещество. Рассматривают как фактор инва-зивности бактерий. Получение гиалуронового субстрата (из пупоч­ных канатиков)—довольно сложная процедура. На практике удоб­нее использовать тест декапсуляции бактерий. В качестве субстрата в этом случае берут культуры бактерий, в капсульном веществе кото­рых есть гиалуроновая кислота (P. multocida серовар A, S. equi).

На поверхность агара в чашке Петри дробно засевают культуру P. multocida или S. equi. Затем в виде линии высевают на поверх­ность среды культуру микроорганизма, у которого выявляют спо­собность к синтезу гиалуронидазы. Чашки с посевами инкубируют 16...24ч при 37 °С. Если исследуемый микроорганизм выделяет гиалуронидазу, то она диффундирует в толщу питательной среды и разрушает капсулу тест-микроба. При анализе посевов в косо-проходящем пучке света колонии S. equi (P. multocida) вблизи «штриха» исследуемой культуры мелкие, серого или голубого цве­та в отличие от флуоресцирующих отдаленных колоний.

Тест на гемолизин. Бактериальные гемолизины — обширная группа веществ-мембранотоксинов, которые вызывают нарушение целостности мембраны эритроцитов и их лизис.

Исследуемую культуру уколом или дробно засевают в чашки Петри с 5%-м кровяным агаром; посевы инкубируют 24 ч при 37 "С. Гемолизин, выделяемый растущей культурой бактерий, диффундирует в толщу агара и вызывает лизис эритроцитов, что проявляется в виде светлой (бета-гемолиз) или полупрозрачной (альфа-гемолиз) зоны вокруг колоний. Гемолитическую актив­ность микроорганизма можно также определять при посеве в 1...5%-й кровяной бульон, который после культивирования выде­ляющего гемолизин микроба становится прозрачным за счет ли­зиса эритроцитов.

Тест на фибринолизин (стрептокиназу). Многие гемолитические стрептококки образуют стрептокиназу, которая активирует протеолитический фермент плазмы (плазминоген — плазмин), этот фермент —фибринолизин растворяет коагулиро­ванную плазму.

Исследуемую культуру микроорганизма засевают в виде «бляш­ки» на агар с 12% цитрированной плазмы. Посевы инкубируют 23...24ч при 37 °С. Положительный результат —появление зоны просветления вокруг колонии.

Тест на лецитиназу. Лецитиназа расщепляет при гидролизе лецитин. Состав желточного агара: пептон — 20 г, гид­рофосфат натрия —2,5г, натрий—1 г, 0,5%-й раствор сульфата магния —0,1 мл, глюкоза— 1 г, агар— 12,5 г, вода дистиллирован­ная — 500 мл. Устанавливают рН 7,2...7,4, стерилизуют 15 мин при 121 °С, охлаждают до 55 X, добавляют один стерильный желток на 500 мл среды, компоненты перемешивают и смесь разливают в чашки Петри.

Исследуемую культуру засевают дробно; культивируют 24...48 ч при 37...38 "С. Положительный результат —появление зоны по­мутнения вокруг колоний.

Тест на ДНК-азу. Исследуемую культуру бактерий засе­вают «штрихом» на питательный агар с ДНК и культивируют 24 ч при 37 "С. Затем на поверхность среды с бактериальной культу­рой наливают 1н. раствор соляной кислоты. Положительный ре­зультат — при гидролизе ДНК светлая зона вдоль «штриха» куль­туры.

Питательная среда с ДНК: в расплавленный МПА добавляют 10%-й раствор ДНК до конечной 0,2%-й концентрации, переме­шивают компоненты, автоклавируют 15 мин при i 20 "С и разлива­ют в чашки Петри.

Тесты на другие ферменты. Как факторы пато-генности можно рассматривать ферменты, катализирующие реакции с образованием токсических продуктов, например: уреаза гидролизует мочевину с образованием аммиака; декар-

боксилаза декарбоксилирует аминокислоты с образованием аминов и др.

Тест на адгезии ы. В адгезии бактерий принимают участие различные компоненты оболочки. Это свойство выявляют по способности исследуемого микроорганизма сорбироваться на различных эукариотических клетках (эритроциты, энтероциты) или других частицах (латекс). Еще один метод обнаружения адге-зинов связан с их использованием в качестве антигенов в сероло­гических реакциях.

У эшерихий адгезивные свойства часто определяют по их спо­собности агглютинировать эритроциты. В лунки планшетов вно­сят по 50 мкл 4%-й суспензии отмытых эритроцитов морской свинки, 1%-й раствор О-маннозы, суспензию исследуемых бакте­рий с концентрацией клеток 10⁹/мл. Параллельно ставят реакцию в отсутствие маннозы. Результат учитывают через 30...60 мин. По­ложительная реакция— склеивание и оседание эритроцитов в виде «зонтика». Торможение агглютинации маннозой обозначают как маннозочувствительную ГА (гемагглютинация), отсутствие ингибирования — как маннозорезистентную ГА.