Тема 10. Микробиологические методы исследования объектов окружающей среды

Для оценки санитарно-гигиенического состояния различных объектов окружающей среды предназначены санитарно-бактерио-логические исследования, целевое назначение которых состоит в определении эпизоотической безопасности. Выявление патоген­ных микроорганизмов служит показателем эпизоотической опас­ности. Однако прямое обнаружение их сопряжено с рядом труд­ностей, связанных прежде всего с низкой концентрацией данных микроорганизмов, которые, как правило, медленно размножаются в воде, почве. Поэтому в санитарно-микробиологической практи­ке применяют косвенные методы, основанные на определении микробной обсемененности того или другого объекта и на обнару­жении в нем так называемых санитарно-показательных бактерий.

О микробной обсемененности судят по микробному числу — общему количеству микроорганизмов, содержащихся в единице объема или массы исследуемого объекта (1 см³ воды, 1 г почвы, 1 м³ воздуха). Содержание санитарно-показательных бактерий оценивают по двум показателям — титру и индексу. Титром называется тот минимальный объем или масса, в которых обнаружива­ются данные бактерии; индексом — число санитарно-показатель-ных бактерий, содержащихся в 1 л жидкости, 1 г плотных веществ, 1 м³ воздуха.

К санитарно-показательным бактериям принадлежат представи­тели облигатной микрофлоры организма животных, для которых средой обитания служат кишечник или дыхательные пути. Они об­ладают следующими свойствами: 1) постоянно выделяются в боль­шом количестве с калом или капельками слизи из дыхательных пу­тей; 2) не имеют других мест обитания; 3) способны сохраняться в окружающей среде в течение тех же сроков, что и патогенные бак­терии, паразитирующие в кишечнике или дыхательных путях; 4) неспособны интенсивно размножаться на каких-либо объектах вне организма хозяина и изменять свои свойства. Все перечисленные признаки присущи ряду бактерий, которые признаны санитарно-показательными для различных объектов окружающей среды.

Санитарно-показательные бактерии группы кишечных палочек (БГКП) принадлежат к разным родам семейства энтеробактерий. Их дифференцируют по различным признакам.

Обнаружение Е. coli в разных объектах окружающей среды, пи­щевых продуктах считается наиболее достоверным показателем свежего фекального загрязнения. Наличие в этих же объектах бак­терий родов Citrobacter и Enterobacter указывает на относительно давнее фекальное загрязнение.

Присутствие С. perfringens, С. sporogenes и других клостридий в почве свидетельствует о ее загрязнении фекалиями, причем как свежем, так и давнем, поскольку эти бактерии образуют споры, что позволяет им длительно сохраняться в окружающей среде (в частности, в почве).

Обнаружение в объектах окружающей среды Streptococcus faecalis также свидетельствует о фекальном загрязнении.

Термофильные бактерии включают группу разных бактерий (Lactobacillus lactis, Streptococcus thermophilus и др.), размножаю­щихся при температуре 60 X и выше. Они не являются постоян­ными обитателями кишечника животных и не служат критериями фекального загрязнения окружающей среды. Резкое увеличение числа этих бактерий в самосогревающемся навозе и компостах может свидетельствовать о загрязнении почвы разлагающимися отбросами.

Бактерии, принадлежащие к роду Proteus (P. vulgaris и др.) се­мейства Enterobacteriaceae, широко распространены в природе. Эти гнилостные бактерии в большом количестве встречаются на разлагающихся останках животных и растений. Обнаружение этих бактерий в каких-либо пищевых продуктах свидетельствует о гни­лостном распаде.

Микрофлора воды. Водопроводную воду засевают в объеме 1 мл, из открытых водоемов — в объемах 1,0; 0,1; 0,01 мл. Все пробы вносят в стерильные чашки Петри, после чего их заливают 10... 12 мл расплавленного и остуженного до 45...50°С питательно­го агара, который тщательно перемешивают с водой. Посевы ин­кубируют при 37 °С в течение 1...2 сут. Воду из открытых водоемов засевают параллельно на две серии чашек, одну из которых инку­бируют при 37 "С в течение суток, а другую — 2 сут при 20 °С. За­тем подсчитывают количество выросших на поверхности и в глу­бине среды колоний и вычисляют микробное число воды — количе­ство микроорганизмов в I мл.

Определение коли-титра и коли-индекса воды. Коли-mump воды измеряется минимальным количеством воды (мл), в котором обнаруживаются БГКП, коли-индекс —- коли­чеством БГКП, содержащихся в 1 л исследуемой воды. Эти пока­затели определяют титрационным (бродильным) методом или ме­тодом мембранных фильтров.

Титрационный метод. Производят посев различных объемов воды в глюкозопептонную среду (1%-я пептонная вода, 0,5%-й раствор глюкозы, 0,5 % раствор хлорида натрия, индикатор Анд-рэдз и поплавок), причем для посевов больших объемов (100 и 10 мл) используют концентрированную среду, содержащую 10-кратные количества указанных веществ.

Воду из открытых поверхностных водоемов исследуют в объе­мах 100, 10, 1 и 0,1 мл. Для исследования водопроводной воды де­лают посевы из трех объемов по 100 мл, трех объемов по 10 мл и трех объемов по 1 мл. Посевы инкубируют в течение суток при 37 "С. О брожении судят по наличию пузырьков газа в поплавке. Из забродивших или помутневших проб производят посевы на среду Эндо. Из выросших колоний делают мазки, окрашивают по Граму и ставят оксидазный тест, позволяющий дифференцировать бактерии родов Escherichia, Citrobacter и Enterobacter от грамотри-цательных бактерий семейства Psendomonadaceae и других оксида-зоположительных бактерий, обитающих в воде. С этой целью стеклянной палочкой снимают 2...3 изолированные колонии с по­верхности среды, наносят штрихом на фильтровальную бумагу, смоченную диметил-л-фенилендиамином. При отрицательном оксидазном тесте цвет бумаги не изменяется, при положитель­ном — она окрашивается в синий цвет в течение 1 мин.

Грамотрицательные палочки, не образующие оксидазу, вновь исследуют в бродильном тесте — вносят в полужидкий питатель­ный агар с 0,5%-м раствором глюкозы и инкубируют при 37 °С в течение суток. При положительном результате определяют коли-титр и коли-индекс по статистической таблице 2.

Метод мембранных фильтров. Мембранный фильтр № 3 поме­щают в воронку ЗеЙтца, вмонтированную в колбу Бунзена, кото­рая присоединяется к вакуу^м~^насосу. Мембранные фильтры пред­варительно стерилизуют кипячением в дистиллированной воде. Воду из водопроводной сети и воду артезианских скважин фильтруют в объеме 333 мл. Чистую воду открытого водоема фильтруют в объеме 100, 10, 1,0 и 0,1 мл; более загрязненную перед фильтро­ванием разводят стерильной водой. Затем фильтры помещают на поверхность среды Эндо в чашки Петри и после инкубации при 37 °С в течение суток подсчитывают число выросших колоний, ти­пичных для БГКП.

Из двух-трех колоний красного цвета готовят мазки, окрашива­ют по Граму и ставят оксидазный тест. Для этого фильтр с вырос­шими на нем колониями бактерий переносят пинцетом, не пере­ворачивая, на кружок фильтровальной бумаги, смоченной диме-тил-я-фенилендиамином. При наличии оксидазы индикатор ок­рашивает колонию в синий цвет. Колонии (2...3), не изменившие первоначальную окраску, засевают в полужидкую среду с 0,5%-м раствором глюкозы. Посевы инкубируют в течение суток при 37 °С. При наличии газообразования подсчитывают число красных колоний на фильтре и определяют коли-индекс.

Микрофлора воздуха. Количественные микробиологические методы исследования воздуха основаны на принципах осаждения (седиментации), аспирации или фильтрации.

Седиментационный метод. Две чашки Петри с пи­тательным агаром оставляют в помещении открытыми в течение 5...10 мин, после чего посевы инкубируют в термостате при 37 °С. Ре­зультаты оценивают по суммарному числу колоний, выросших на обе­их чашках: менее 250 колоний — воздух считается чистым; 250...500 — загрязненным в средней степени; более 500 колоний — загрязненным.

Аспирационный метод. Наиболее точный количе­ственный метод определения микробного числа воздуха. Посев воздуха осуществляется с помощью приборов.

Аппарат Кротова (рис. 43) устроен таким образом, что воздух с заданной скоростью засасывается через узкую щель плексигласо­вой пластины, закрывающей чашку Петри с питательным агаром. При этом частицы аэрозоля с содержащимися на них микроорга­низмами равномерно оседают на всю поверхность среды благода­ря постоянному вращению чашки под входной щелью.

Для определения микробного числа воздуха используют питательный агар, для выделения гемолитических стрептокок­ков — кровяной агар с добавлением генци-анового фиолетового с последующим кон­трольным микроскопированием и выбо­рочным пересевом подозрительных коло­ний на кровяной агар.

Состав сред. Кровяной агар с ген-циановым фиолетовым: 2 % питательного агара, 5...10% дефибринированной крови (лошади, кролика или барана) и генциано-вый фиолетовый (1:50 000). Желточно-солевой агар: 2% пита­тельного агара, 10 % хлорида натрия, 20 % (по объему) желточной взвеси (1 желток куриного яйца на 200 мл изотонического раство­ра хлорида натрия).

Для исследования воздуха служат и другие приборы (Дьякова, Речменского, Киктенко, ПАЕ-1 — пробоотборник аэрозольный бактериологический, ПОВ-1 — прибор для отбора воздуха), в ко­торых определенный объем воздуха пропускается через жидкости или фильтры, а затем делают мерные посевы на питательные сре­ды. Приборами ПАБ-1 и ПОВ-I можно исследовать большие объемы воздуха и обнаруживать патогенные бактерии и вирусы. Воздух микробиологических боксов, хирургических, акушерско-гинекологических и других помещений исследуют с целью обна­ружения патогенных и условно-патогенных бактерий — возбуди­телей инфекций (стафилококки, синегнойные палочки и другие грамотрицательные бактерии).

Микрофлора почвы. При санитарно-микробиологическом ана­лизе почвы определяют микробное число, коли-титр, перфрин-генс-титр и титр термофильных бактерий. В необходимых случаях исследуют состав нитрифицирующих и аммонифицирующих бак­терий, актиномицетов, грибов, целлюлозных и других микроорга­низмов.

Почву для исследования берут на глубине 10...15 см стериль­ным ножом (из разных мест исследуемой территории не менее 10 проб) и помещают в стерильную банку. Из проб готовят навеску (30 г), которую вносят в колбу с водой (270 мл) и тщательно встряхивают. Из полученной суспензии готовят разведения 10¹, 10⁴, 10^s. Из двух последних разведений берут 0,1 мл и смешивают с 40 мл 0,7%-го расплавленного и остуженного до 45 °С питательного ага­ра, после чего выливают вторым слоем в чашки Петри с 2%-м пи­тательным агаром. Посевы инкубируют при 37 X. Затем подсчи­тывают число выросших колоний и определяют микробное число.

Определение коли-титра, перфрингенс-титра и титра термофильных бактерий п о -ч в ы. Различные разведения почвенной суспензии засевают по 1 мл в пробирки со средой Кесслера и инкубируют при 43 °С в те­чение 48 ч. В дальнейшем анализ проводят по схеме, применяемой при определении коли-титра воды.

Для определения перфрингенс-титра различные разведения почвенной суспензии (1 мл) засевают в пробирки со стерильным обезжиренным молоком или железосульфитной средой Вильсо­на—Блера, приготовленной ex tempore. Посевы инкубируют при 43 °С в течение 24...48 ч, после чего учитывают результаты по свер­тыванию молока или по образованию черных колоний Clostridium peifringens в агаровом столбике среды Вильсона—Блера. Из коло­ний делают мазки, окрашивают по Граму, микроскопируют и вы­числяют перфрингенс-титр.

Для определения титра термофильных бактерий разведения по­чвенной суспензии {1 мл) вносят в чашки Петри, заливают рас­плавленным и охлажденным питательным агаром. Посевы инку­бируют в течение суток при 60 °С, а затем подсчитывают число выросших колоний и пересчитывают на 1 г почвы.

Санитарно-микробиологическую оценку почвы производят по комплексу показателей, из которых наиболее важным является ус­тановление степени фекального загрязнения.

Состав сред. Среда Кесслера: 1 % пептона, 5 % желчи, 0,25 % лактозы, генциановый фиолетовый для подавления роста грам положительных бактерий. Железосульфитная среда Вильсона — Блера: 3 % питательного агара, 1 % глюкозы, 2 % сульфита натрия, 0,08 % хлорида железа.