Приготовление микроскопических препаратов.

Для микроскопи­ческого исследования с целью выявления форм микробов, их структурных и биохимических особенностей препарат готовят на предметном стекле. В качестве материала применяют взвеси бак­терий; непосредственно бактериальную культуру, выросшую на жидкой или плотной среде; молоко, кровь, гной (препарат-ма­зок); ткани печени, селезенки или других органов (препарат-отпе­чаток, кляч-препарат).

Для приготовления препарата на рабочем столе должны быть: исследуемый материал (взвесь бактерий, микробные культуры, гной и др.), обезжиренные предметные стекла, бактериологичес­кая петля, газовая (или спиртовая) горелка, бутыль с сифоном ди­стиллированной воды, сливная чашка с «мостиком», красители, фиксирующие и протравливающие жидкости.

Для приготовления препарата-мазка из жидкой микробной куль­туры (или гноя) в левую руку берут пробирку с материалом, в пра­вую — бактериологическую петлю (как пишущее перо). Петлю тщательно прожигают на пламени горелки, не выпуская из рук, осторожно около пламени открывают пробирку свободными пальцами (мизинцем и безымянным) правой руки, петлей захва­тывают каплю материала, пробирку закрывают и ставят в штатив. Свободной левой рукой берут предметное стекло, наносят на его поверхность каплю и легкими круговыми движениями растирают по стеклу, затем препарат высушивают на воздухе (рис. 15), петлю прожигают.

Высохший препарат фиксируют (закрепляют) на стекле. Для этого чаще используют физический способ: препарат (обратной стороной мазка) 2—3 раза быстро проводят над пламенем горелки. Из фиксирующих химических средств применяют эфир, этиловый или метиловый спирт, формалин, смеси формалин-спирт и спирт-эфир. Для фиксации высушенный препарат помещают в стакан­чик с фиксирующей жидкостью (или 1...2 капли жидкости нано­сят на препарат) и выдерживают 3...5 мин. Затем мазок промыва­ют водой, высушивают фильтровальной бумагой. С обратной сто­роны стекла препарата восковым цветным карандашом обводят границу (зону) мазка, чтобы после окраски точно знать место его нахождения.

Для приготовления препарата из бактериальной культуры, вы­росшей на плотной среде, на предметное стекло петлей наносят каплю стерильного физиологического раствора, затем, прокалив петлю на огне, берут ею небольшое количество микробной массы из пробирки с поверхностного слоя (рис. 16) и аккуратно растира­ют в капле физиологического раствора на предметном стекле тон­ким равномерным слоем. В остальном поступают, как описано выше.

Пересев культур. При пересеве микробных культур из одной пробирки в другую обе пробирки удерживают в одной руке, как показано на рисунке 17. Последовательность действий изображе­на на рисунке 18. Посев уколом делают с использованием бакте­риологической петли, которую вводят в столбик плотной пита­тельной среды (рис. 19).

Методы окрашивания микроорганизмов. Простой метод окраски. При данном методе используют только один краси­тель. На фиксированный препарат, помещенный на мостике над сливной чашкой, наливают раствор либо метиленовой сини (окра­шивают 4...5 мин), либо карболовый фуксин Пфейффера <1...2мин), либо карболовый генцианвиолет (1...2мин). Краску

Рис. 15. Этапы приготовления мазка-препарата из микробной культуры (1...

S)

смывают водой из бутыли, препарат высушивают фильтровальной бумагой и наносят каплю иммерсионного масла. Готовый препа­рат помешают на предметный столик и микроскопируют.

Сложные (дифференцирующие) методы окраски. Отличаются от простых методов тем, что препарат окрашивают несколькими красками, а в отдельных случаях ис­пользуют еще специальные реактивы (раствор Люголя, кислоты и др.). Сложные методы позволяют выявить наличие (или отсут­ствие) отдельных структурных элементов и некоторых органичес­ких соединений клетки, чем и определяют тинкториальные свой­ства каждого вида микроба.

Рис. 16. Отбор микробной массы с

поверхности плотной питательной

среды

Рис. 17. Пересев культур в пробирки с питательной средой

' Этапы пересева микробной культуры (/...6)

Рнс. 19. Посев уколом

Метод окраски по Граму. Фик­сированный препарат окрашива­ют карболовым генцианвиоле-том в течение 2...3 мин. Не смы­вая водой, краску сливают и на 2...3 мин на препарат наносят ра­створ Люголя (йода кристалли­ческого — 1 г; йодистого калия как растворителя йода — 2 г; дис­тиллированной воды — 300 мл). Раствор Люголя сливают; препа­рат, не промывая водой, обраба­тывают 96%-м спиртом в течение ЗОс, затем хорошо промывают водой. После этого препарат до­полнительно окрашивают рабочим раствором фуксина (до 1 мин), вновь промывают водой, сушат фильтровальной бумагой и микро-скопируют.

При окраске по Граму одни виды бактерий не обесцвечиваются спиртом после первичного окрашивания и сохраняют фиолетовый цвет; их называют грамположительными. Другие виды обесцвечи­ваются спиртом, а затем воспринимают дополнительную окраску фуксином и приобретают розово-красный цвет; их называют грамотрицательными (цв. рис. III). Окрашивание по Граму обус­ловлено структурными особенностями клеточной стенки у грам-положительных и грамотрицательных групп микробов, длиной и формой ее пор, неодинаковым химическим составом и строением пептндогликанового слоя клеточной стенки микроорганизмов. Генцианвиолет (или кристаллвиолет) и нуклеиновые кислоты ци­топлазмы в присутствии йода (раствор Люголя) образуют прочный комплекс, нерастворимый в воде и слаборастворимый в спирте. Поэтому при действии спиртом в течение 30 с бактерии с много­слойным пептидогликановым каркасом (грамположителъные) не обесцвечиваются. У грамотрицательных бактерий пептидоглика-новый слой имеет более крупные поры, что облегчает прохожде­ние спирта; образовавшийся комплекс разрушается, клетка обес­цвечивается.

Методы окраски кислота-, спирте-, щеяочеустойчивых бакте­рий. Микробы данной группы (микобактерии туберкулеза, парату-беркулезного энтерита крупного рогатого скота, проказы человека и др.) принадлежат к грамположительным бактериям. Для их диф­ференциации применяют специальные методы окрашивания, ос­нованные на различной химической структуре цитоплазмы и кле­точной оболочки. В состав этих бактерии входит значительное ко­личество жировосковых веществ, в частности стеариновых кислот (в том числе фтионовой кислоты до 40%), поэтому они трудно воспринимают краски. Но если они окрасились при воздействии протравителя, то трудно уже обесцвечиваются кислотами, спирта­ми и щелочами.

Наиболее распространенным метолом окраски бактерий дан­ной группы является метод Циля—Нильсена. На фиксированный препарат кладут кусок белой фильтровальной бумаги (для предо­хранения от осадка), на него наливают раствор карболового фук­сина, снизу препарат подогревают над пламенем до появления па­ров и оставляют на «мостике» (5...7 мин). Затем краску с бумажкой сливают (не промывая) и обесцвечивают 3...5%-м раствором сер­ной кислоты (5...7 с), хорошо промывают водой и дополнительно окрашивают метиленовой синью Леффлера (4...5 мин). Далее пре­парат промывают водой и высушивают фильтровальной бумагой. Кислотоустойчивые (спирто-щелочеустойчивые) бактерии окра­шиваются в красный цвет (не обесцвечиваются кислотой), а не­кислотоустойчивые — в синий, так как легко окрасившись фукси­ном, они легко обесцвечиваются кислотой и воспринимают вто­ричную окраску синью.

Методы окраски непостоянных элементов микробной клетки. В структуре микробной клетки различают постоянные и непостоян­ные элементы. Постоянные — это цитоплазма, оболочка, ядерное вещество; непостоянные — спора, капсула, жгутики, которые при определенных условиях формируются лишь у бактерий отдельных видов, поэтому служат видовым признаком.

Окраска спор. Палочковидные микробы, образующие во внешней среде (почве, воде, кормах, на питательных средах) стойкую форму существования — спору, называют бациллами. При спорообразовании в клетке происходят процессы, обусловливаю­щие сгущение цитоплазмы, уменьшение свободной воды (до 40 %). Цитоплазматическое содержимое покрывается многослой­ными оболочками, химический состав которых обеспечивает вы­сокую стойкость споры к нагреванию, высушиванию, действию многих кислот, шелочей, красителей. При законченном спорооб­разовании спора лежит свободно, без остатков вегетативной клет­ки; при незаконченном процессе спора, в зависимости от вида микроба, располагается либо в центре клетки, либо на конце (тер­минально), либо между концом и центром клетки (субтерминаль­но). При микроскопировании препаратов, окрашенных простым методом или по Граму, видна окрашенная вегетативная часть клетки и неокрашенные, хорошо преломляющие свет споры.

Метод Ауески. Высушенный на воздухе препарат, не фиксируя, протравливают 0,5%-й соляной кислотой с подогреванием (2...3 мин), охлаждают, промывают водой и фиксируют над пламе­нем. Затем на препарат кладут кусочек фильтровальной бумаги, наливают на него карболовый фуксин Циля, окрашивают с подо­греванием до паров (7...8 мин), краску сливают, препарат обраба­тывают 5%-м раствором серной кислоты (5...7с), хорошо промы­вают водой. Дополнительно окрашивают метиленовой синью (4...5 мин), опять промывают водой и просушивают фильтроваль­ной бумагой. Микроскоп ируют под иммерсией: вегетативная часть клетки — синяя, споры — красные (цв. рис. IV).

Метод Меллера. Фиксированный на пламени препарат про­травливают 5%-й хромовой кислотой (2...3мин), промывают во­дой, просушивают фильтровальной бумагой. Далее поступают, как в предыдущем методе. Результат окраски тот же: вегетативная часть клетки — синяя, споры — красные.

Метод Златогорова. Процесс окраски, как в предыдущих двух методах, только без протравы. После окрашивания вегетативная часть клетки — синяя, споры — красные.

Метод Пешкова. Мазок фиксируют, красят метиленовой синью с подогреванием до кипения, смывают. Докрашивают 1%-м вод­ным раствором нейтральрота (10 с), смывают, просушивают. Спо­ры окрашиваются в синий цвет, вегетативные клетки — в крас­ный.

Окраска капсул. Капсула — производное наружного слоя оболочки. Представляет собой мупиноподобное вещество, высокомолекулярный полисахарид. У патогенных капсулообразу-юших бактерий наличие капсулы наблюдают только в инфициро­ванном организме как защитное приспособление против фагоци­тоза (на искусственных питательных средах капсулы образуются лишь при добавлении кровяной сыворотки или дефибринирован-ной крови). Капсулообразование отмечают у возбудителей сибир­ской язвы, злокачественного отека, диплококковой септицемии. Капсульное вещество плохо окрашивается, поэтому для его выяв­ления применяют специальные методы окраски, основанные на явлении метахромазии.

Метод Михина. Фиксированный мазок из крови или препарат-отпечаток из ткани органа (печени, селезенки, почки) окрашива­ют метиленовой синью с подогреванием до появления паров (5...7 мин). Краску сливают, быстро промывают водой (можно не промывать), просушивают фильтровальной бумагой. Микробная клетка окрашивается в синий цвет, капсула — в светло-розовый.

Метод Романовского—Гимза. Фиксированный препарат окра­шивают, как было указано выше: мазок-препарат помещают в чашку Петри на стеклянные или деревянные палочки отпечатком вниз, под препарат подливают краску, окрашивают 40...50 мин. Результат тот же, что и при окраске по Михину: микробная клетка окрашивается в синий цвет, капсула — в светло-розовый.

Метод Ольта. Свежий водный 2%-й раствор сафранина нали­вают на препарат и выдерживают 5...7 мин. Затем слегка промыва­ют водой и высушивают. Вегетативная клетка — кирпично-крас­ного цвета, капсула — желто-оранжевого.

Приготовление мазков из крови и окраска спирохет. На чистое обезжиренное стекло, ближе к одному из его концов, нанести кап­лю крови. Другое предметное стекло со шлифованным краем прижать под углом 45° к капле крови, а затем скользящим движением передвинуть его к другому концу нижнего стекла. При этом кровь распределится по предметному стеклу тонким слоем. Высушить препарат на воздухе, зафиксировать в жидком фиксаторе (метило­вый спирт или смесь этилового спирта и эфира).

Окрасить препарат по методу Романовского— Гимза (смесь ме-тиленового синего, эозина и азура). На мазок нанести рабочий ра­створ красителя (2 капли красителя на 1 мл дистиллированной воды) на 10...20 мин. Затем препарат промыть водой и высушить на воздухе.

Лептоспиры окрашены в розово-сиреневатый, эритроциты крови — в розовый, ядра лейкоцитов — в фиолетовый цвет.

Окраска ршкетсий по методу Здродовского. Окрашивать мазок разведенным фуксином Циля (10...15 капель на 10 мл дистилли­рованной воды) в течение 5 мин, промыть водой. Обработать мазок 0,5%-м раствором лимонной кислоты или 0,01%-м раствором хлоро­водородной кислоты, промыть водой. Окрасить метиленовой си­нью в течение 1 мин, промыть водой и высушить препарат.

Риккетсии, окрашенные по методу Здродовского, — красного цвета, цитоплазма клеток, в которых они паразитируют, — голу­бая, ядра — синие.

Жгутики имеются только у подвижных видов бактерий. Они очень тонкие (менее разрешающей способности микроско­па), окрашиваются плохо, поэтому при световой микроскопии к окраске жгутиков прибегают редко. Чаще бактерий исследуют в живом состоянии (без окраски), определяя их подвижность. У разных видов число и расположение жгутиков неодинаковое (см. рис. 13).