Демонстрация фагоцитоза бактерии.

К фагоцитирующим клет­кам относят полиморфноядерные лейкоциты крови. Поглощение микробной клетки фагоцитом может не сопровождаться гибелью микроорганизма (незавершенный фагоцитоз) или приводить к внутриклеточному перевариванию захваченных бактерий (завер­шенный фагоцитоз).

Белой мыши внутрибрюшинно вводят 2 мл стерильного МПБ, затем через 2...3 ч — 0,5 мл культуры эшерихий. Спустя 20...40 мин шприцем из брюшной полости отбирают экссудат, делают мазки на предметном стекле, фиксируют спирт-эфиром и окрашивают метиленовой синью (экспозиция 2...3 мин). При микроскопирова-нии можно наблюдать различные стадии фагоцитоза: поглощение, деструкцию (переваривание) клеток (цв. рис. VI).

Методы оценки активности фагоцитиру­ющих клеток. Для оценки активности фагоцитов использу­ют следующие показатели: фагоцитарный показатель — процент фагоцитирующих клеток от общего числа учтенных нейтрофиль-ных лейкоцитов; фагоцитарное число — среднее число микробных клеток, поглощенных одним лейкоцитом (характеризует интен­сивность фагоцитоза).

Определение фагоцитарного показателя. В чистую стерильную центрифужную пробирку вносят 0,2 мл 2%-го раствора цитрата натрия, 0,1 мл крови морской свинки или кролика и 0,05 мл суспензии убитых нагреванием бактерий S. epidermidis, Е. сок или других (концентрация 0,5 ■ 109 клеток по оптическому стандарту мутности). Компоненты перемешивают и выдерживают при 37...38°С в течение 30 мин, затем центрифугируют 15,..20мин при 2500...3000 мин"1 до разделения на прозрачный слой плазмы, слой эритроцитов и тонкий сероватый средний слой лейкоцитов. Осторожно отсасывают плазму, пипеткой берут средний слой, дела­ют 3...5 мазков и окрашивают по методу Романовского—Гимза. Пре­парат микроскопируют, подсчитывают не менее 100 нейтрофильных лейкоцитов и определяют среди них число (%) фагоцитирующих.

Методы оценки иммунного статуса макроорганизма.

Работа им­мунной системы, как и любой другой системы организма, может нарушаться, что неизбежно повысит восприимчивость животного к инфекционным заболеваниям.

Методы оценки Т-системы иммунитета (клеточный иммунитет). Из числа существующих методов оценки Т-иммунитета наиболее известны следующие.

Метод «спонтанных розеток» (Е—РОК). Т-лим-фоциты несут на своей поверхности рецепторы, реагирующие с мем­бранными структурами эритроцитов барана. После сорбции эритро­цитов Т-клетки приобретают форму «розетки», что позволяет выяв­лять их в популяции лимфоцитов. Реакцию проводят в 3 этапа.

Выделение лимфоцитов барана: в центрифужную пробирку на­ливают 2 мл разделяющего раствора, состоящего из 9%-го водного раствора фиколла и визотраста-370, доведенного до плотности 1,077 г/мл (соотношение 8 : 2). Затем на разделяющий раствор ос­торожно наслаивают 2...4 мл крови с гепарином (100 МЕ/мл), раз­веденной средой Игла в соотношении 1 : 2...1:4. Смесь центрифу­гируют при 600 мин~¹ и температуре 20 °С. Лимфоциты, сконцент­рированные в виде беловатого слоя над разделяющим раствором, отсасывают пастеровской пипеткой и отмывают средой Игла (при 600 мин""¹ — 10 мин два раза, 200 мин"¹ — 10 мин один раз).

Инкубация средой Игла: концентрацию лимфоцитов доводят до 3 ■ 10⁶/мл. Готовят суспензию эритроцитов барана: эритроциты отмывают 0,15 М раствором хлорида натрия (три раза), затем из них готовят 0,5%-ю суспензию в среде Игла. Далее смешивают по 0,5 мл суспензии лимфоцитов и эритроцитов, смесь центрифуги­руют при 200 мин"¹ в течение 5 мин и оставляют при 4 °С на 18 ч.

Учет реакции: осторожно покачивая пробирку, ресуспендиру-ют осадок (не перемешивая), каплю суспензии вносят в счетную камеру и исследуют методом фазою-контрастной микроскопии. Просматривают не менее 200 лимфоцитов и подсчитывают те клетки, к поверхности которых прикреплено более трех эритро­цитов — естественные розеткообразующие клетки (Е—РОК).

Технология выращивания животных отражается на их физио­логическом состоянии и на количестве Т- и В-клеток в частно­сти.

Выявление Т-хелперов и Т-супрессоров. Т-хелперы и Т-супрессоры несут на своей поверхности специфи­ческие антигены, которые можно обнаружить при помощи мыши­ных моноклональных антител в реакции непрямой иммунофлуо-ресценции. Лимфоциты, связавшие моноклональные антитела, светятся по периферии клеток, что позволяет определить их коли­чество при микроскопическом исследовании.

Методы оценки В-системы иммунитета (гуморальный иммуни­тет/ Включают в себя оценку В-лимфоцитов (общее содержание в крови, анализ антигенных детерминант) и вырабатываемых ими антител.

Количественное определение иммуно­глобулинов разных классов методом радиальной иммунодиффузии (по Манчини). Количество и соотношение им­муноглобулинов отдельных классов в биологических жидкостях отражают состояние В-системы. Иммунную сыворотку против ан­тител определенного класса (IgG, IgM, IgA) вносят в расплавлен­ный агаровый гель. После застывания агара антитела в нем равно­мерно распределены. Внесенный в лунку исследуемый материал (антиген) радиально диффундирует в толщу геля. Поскольку кон­центрация антител везде одинакова, то в результате реакции анти­ген — антитело в зоне эквивалентности образуются не полосы преципитации, а кольцо преципитации вокруг лунки с антигеном. Диаметр кольца преципитации прямо пропорционален концент­рации антигена в исследуемой жидкости.

В предварительных опытах определяют оптимальное (рабочее разведение) антисывороток к иммуноглобулинам каждого класса. В каждом опыте устанавливают количество иммуноглобулинов в стандартной сыворотке и по отношению к ней определяют коли­чество иммуноглобулинов в исследуемом материале.

Используют 3%-й агар Дифко на веронал-мединаловом буфере с рН 7,3...7,4 (мединал — 35,4г, веронал — 5,25 г, дистиллирован­ная вода —до 1000 мл). В бактериологической пробирке смешива­ют по 5 мл расплавленного агара и антисыворотки. Берут два стек­ла размером 9 х 12 см, на одно из них помещают П-образную рам­ку, сверху кладут второе стекло. Толщина рамки составляет 1 мм. В щель между стеклами заливают смесь агара и антисыворотки, оставляют в вертикальном положении для застывания агара на 15...20 мин. Затем удаляют одно из стекол и рамку.

В агаре пробойником вырезают лунки диаметром 2 мм (5 рядов по 7 лунок в каждом). В лунки первого ряда вносят разведения стандартной сыворотки, в остальные — исследуемые пробы по 1 мкл. Пластинку выдерживают во влажной камере 24 ч (igG, IgA) или 48 ч (IgM).

Строят калибровочную кривую. На оси абсцисс откладывают значения диаметров колец преципитации разведенной стандарт­ной сыворотки, на оси ординат —значения концентраций имму­ноглобулинов ( % или мг/мл). Измеряют диаметр колец преципи­тации в пробах и по калибровочной кривой устанавливают кон­центрацию соответствующего иммуноглобулина.

Все методы определения В-лимфоцитов в крови основаны на вы­явлении на поверхности В-лимфоцита структур, специфических только для В-клеток: рецепторы к (^-фрагменту иммуноглобули­нов, рецепторы к Сз-фракции комплемента, иммуноглобулиновые рецепторы, а также специфические В-антигены.

Метод розеткообразования (ЕАС—РОК). Эрит­роциты барана обрабатывают антителами гемолизина, затем ком­плементом. Образуется комплекс АГ—AT—С, содержащий компо­нент комплемента С₃-фракции. Далее смешивают лимфоциты жи­вотного и обработанные эритроциты барана. Эритроциты за счет присутствующих на их поверхности молекул С₃ избирательно сор­бируются на В-лимфоцитах, образуя «розетки».

Другие методы основаны на выявлении рецепторов к Р_с-фрагментам иммуноглобулинов и иммуноглобулиновых детер­минант на поверхности В-клеток. Рецептор к Р_с-фрагменту имму­ноглобулинов способен связывать агрегированный у-глобулин, меченный флуорохромом, что можно в последующем установить при помощи флуоресцентного анализа.

Используют меченные флуорохромом антиглобулиновые сыво­ротки или антисыворотки против иммуноглобулинов отдельных классов, например моноклональные антитела.