Тема 22. Патогенные микобактерии Возбудитель туберкулеза.

Открыт Кохом (1882), принадлежит к порядку Actinomycetales, семейству Mycobacteriaceae, роду Mycobacterium. Микобактерии отличаются ветвистостью, располо­жением в виде буквы V и разнообразием видов, в том числе пато­генных (рис. 66).

Наибольшее значение в патологии сельскохозяйственных жи­вотных и человека имеют следующие виды микобактерии; М. tuberculosis — возбудитель туберкулеза человека, М. bovis — возбу­дитель туберкулеза крупного рогатого скота, М. avium — возбуди­тель туберкулеза птиц.

Туберкулез характеризуется образованием в различных тканях и органах специфических очагов — бугорков (туберкул), по мере

Рис. 66. Формы мхкобактернй

развития процесса подвергающихся творожистому перерождению. При разных формах течения туберкулеза отмечают повышение температуры, увеличение лимфатических узлов, прогрессирующее истощение организма, а при поражении органов дыхания —ка­шель.

Бактериологический диагноз. Основан на мик­роскопии мазков-препаратов из патологического материала, вы­делении чистой культуры возбудителя туберкулеза и заражении лабораторных животных. Исходя из того что туберкулез протекает преимущественно в скрытой форме (латентно), для своевремен­ного выявления больных применяют аллергический метод диагно­стики при помощи аллергена туберкулина.

Для бактериологического анализа направляют при жизни жи­вотного истечения из носа, бронхиальную слизь, молоко (особен­но при увеличении надвыменных лимфоузлов) — не менее 100 мл, фекалий — 30...50, реже мочу — 200 мл. Посмертно или после убоя отправляют кусочки органов с изменениями и бронхиальные, заг­лоточные, средостенные, предлопаточные, надвыменные лимфо­узлы.

При взятии патологического материала необходимо соблюдать правила асептики и профилактические меры, технику безопаснос­ти. Материал в лабораторию лучше доставлять свежим. Если нет такой возможности, то лимфоузлы, кусочки органов консервиру­ют в 30...40 %-м водном растворе глицерина. Обсемененность ис­следуемого материала микобактериями туберкулеза может быть незначительной. Для большей достоверности результатов иссле­дования применяют специальные методы обработки и обогаще­ния, чтобы повысить концентрацию возбудителя в пробах.

Бронхиальную слизь (мокроту) собирают в пробирки с 6%-м раствором серной кислоты, закрывают резиновой пробкой, про­мывают 5...6 мин встряхиванием, центрифугируют, кислоту отса­сывают, к осадку добавляют физраствор, вновь встряхивают и центрифугируют. Так промывают 2...3 раза. Промытый осадок вы­севают на питательные среды и готовят мазки.

Молоко центрифугируют. Осадок обрабатывают также раство­ром серной кислоты, промывают физраствором, центрифугируют. Из осадка готовят препараты-мазки и производят посев на пита­тельные среды.

Масло (2...4 г) вносят в стерильную пробирку, заливают горя­чей водой, закрывают резиновой пробкой, встряхивают 5...10 мин, переворачивают пробирку вверх дном, ставят в штатив и оставля­ют в прохладном месте. Когда масло застынет, осторожно приотк­рывают пробку, жидкость выливают в центрифужные пробирки и далее исследуют как молоко.

Пораженные ткани нарезают мелкими кусочками и растирают в стерильной ступке с 6%-й серной кислотой в соотношении 1: 4, фильтруют через марлю и центрифугируют. Из осадка готовят мазки и производят посевы на питательные среды. Фекалии (50 г) растирают в стерильной ступке с 18 %-м раствором серной кисло­ты, фильтруют через марлю и центрифугируют, исследуют осадок, как в предыдущих случаях.

Содержимое туберкул дополнительно исследуют микроскопи-рованием препаратов, приготовленных из растертых кусочков тво­рожистой массы очажка между двумя предметными стеклами.

Возбудитель туберкулеза относится к группе кислого-, спирто-шелочеустойчивых бактерий, что обусловлено наличием стеари­новых кислот (миколовой, фтионовой) и Других воскоподобных веществ в оболочке микробной клетки. Эти вещества придают микробной клетке гидрофобность, то есть способность отталки­вать воду и водные растворы красителей, кислот и щелочей. В свя­зи с этим бактерии туберкулеза трудно воспринимают краску. Для окрашивания этой группы бактерий применяют специальные ме­тоды, среди которых наиболее распространенным является метод Циля — Нильсена, при котором микобактерии окрашиваются в розово-красный цвет (цв. рис. XII). Грамположительны. Для мик­роскопического исследования патологического материала реко­мендован также люминесцентный метод.

Возбудитель туберкулеза палочковидной формы, длиной 1,5...5мкм и шириной 0,5 мкм. М. tuberculosis — тонкая слегка изогнутая палочка, М. bovis — короткая и толстая, М. avium — мельче остальных видов, обладает полиморфизмом. Микобакте­рии туберкулеза неподвижные, не образуют капсулу и спору. В мазках из исследуемого материала располагаются одиночно и в виде небольших скоплений. В мазках из культур помимо одиноч­ных бактерий встречаются длинные нити с разветвлениями. Часто проявляются неравномерность в окрашивании, наличие в цитоп­лазме зернистости (грамположительные некислотоустойчивые «зерна Муха»), Микобактерии — аэробы. Растут только на специ­альных средах с добавлением глицерина.

Выделение чистой культуры. Для выделения возбудителя из патологического материала используют электив­ные (избирательные) среды — яично-крахмальные, картофельные с глицерином и краской (малахитовая зелень) для задержки роста посторонних микроорганизмов.

Для культивирования используют также синтетические среды, например Финна, Дорсе и Моделя.

Среда Дорсе представляет собой тщательно растертое яйцо с 10 мл раствора Рингера. Затем эту смесь взбалтывают в сосуде с бусами и разливают по пробиркам, стерилизуют дробно: 3 сут при 75 "С по 1 ч.

Среда Моделя: двухосновный фосфат калия — 5 г, цитрат аммо­ния — 10 г, сульфат магния — 0,5 г, сульфат железа — 0,05 г, глице­рин — 50 мл, дистиллированная вода — 1 л, рН среды 7,2. Стери­лизуют 20 мин при 115°С.

Культивировать можно и на обычном картофеле, пропитанном 3...4 %-м глицерином, в глицериновом МПБ и на глицериновом МПА. Срок инкубации при 37 °С от 3...4 нед до 2...3 мес. Рост учи­тывают каждые 5...7сут. Отдельные виды микобактерий могут проявить рост через 2...4 нед.

Культуральные свойства. М. tuberculosis в глице­риновом бульоне на поверхности среды растут в виде толстой складчатой пленки с широким пристеночным кольцом. На плот­ных средах рост обильный, колонии сухие бородавчатые или сморщенные, иногда в виде узелков цвета слоновой кости (цв. рис. XIII). М. bovis в бульоне образует пленку нежную, иногда сетчатую, не покрывающую всей поверхности среды. На плотных средах рост скудный, колонии сухие, мелкие, зернистые, серова­то-белого цвета. М. avium в жидких средах образует сначала сухую, затем ослизняющуюся пленку по всей поверхности среды. На плотных средах влажный и слизистый налет. Колонии серовато-белые или желтоватого цвета с пуговицеобразным круглым возвы­шением, иногда кратерообразным углублением. Растет быстрее, чем остальные виды микобактерий.

При исследовании масла следует учитывать возможность нали­чия кислотоустойчивых сапрофитов (М. phlei и др.), которые рас­тут на питательных средах очень быстро (4 ...7 сут) по сравнению с патогенными микобактериями.

Чистую культуру микобактерий определяют на видовую при­надлежность. Одним из распространенных методов дифференциа­ции является культивирование в глицериновом бульоне с 5 % жел­чи. Каждый вид микобактерий растет в присутствии желчи соот­ветствующего вида животного: М. avium —в присутствии только птичьей желчи, М. bovis — с добавлением желчи крупного рогатого скота. Наличие миколовой кислоты в клетках способствует тому, что патогенные штаммы растут на питательных средах в виде ко­сичек, хорд.

Биопробу используют для определения патогенности и диффе­ренциации видов бактерий туберкулеза. Заражают морских свинок, кроликов и при необходимости кур, предварительно проверенных аллергическим методом для исключения спонтанного туберкулеза. Для заражения применяют выделенную культуру или присланный в лабораторию материал. Последний предварительно обрабатывают по Гону серной кислотой, как указывалось выше, растирая в сте­рильной ступке. Затем к осадку после центрифугирования добавля­ют 15%-й раствор гидрокарбоната натрия (двууглекислой соды), ос­тавляют на 10...15 мин и вновь центрифугируют 5 мин. Образовав­шийся осадок дважды промывают стерильным физиологическим раствором NaCl с последующим центрифугированием, а затем оса­док вновь эмульгируют в физиологическом растворе, отстаивают 5... 10 мин. Надосадочную жидкость вводят в дозе 1...2мл: морским свинкам в паховую область, кроликам — внутривенно.

У морских свинок в положительных случаях через 2...3нед на месте введения образуется уплотнение, затем язва с одновремен­ным увеличением регионарных лимфоузлов. Далее этим свинкам через 2...3 нед подкожно вводят туберкулин, что приводит к бурной генерализации процесса и гибели животных. При вскрытии из ти­пичных туберкулов готовят мазки и делают посевы. М. bovis вызы­вает генерализованный процесс туберкулеза у кроликов и морских свинок. М. tuberculosis патогенны лишь для морских свинок, вызы­вая заболевание в период от 3 нед до 3 мес после заражения. М. avium, как правило, обусловливает у кроликов септический процесс без образования специфических бугорков и приводит к быстрой ги­бели животных (особенно при внутривенном заражении).

Дифференциация. Для дифференциации отдельных видов микобактерий лучше заражать животных суспензией выра­щенных культур. Если у выделенных культур слабая вирулент­ность и атипичный рост, то микобактерий необходимо дифферен­цировать от кислотоустойчивых сапрофитов. Для этого использу­ют следующие тесты:

1. Определение каталазной активности. В пробирку с вырос­ шей культурой на яичной среде вносят 50%-й раствор пергидро­ ля, чтобы вся поверхность среды с культурой была покрыта. С момента появления пузырьков газа учитывают результат — стол­ бик пены измеряют в миллиметрах (мм). Каталазной активнос­ тью обладают все кислотоустойчивые бактерии, но у сапрофитов она интенсивнее.

2. Определение лекарственной устойчивости. Осуществляют с культурами, выращенными на питательных средах с добавлением различных концентраций туберкулостатических препаратов (стрептомицин, ПАСК и др.). Вирулентные штаммы М. tuberculosis, M. bovis, как правило, чувствительны к действию этих препаратов. Между тем атипичные штаммы, кислотоустойчивые сапрофиты и М. avium обладают устойчивостью в отношении ан­ титуберкулезных лечебных препаратов, особенно к фтивазиду и ПАСК (парааминосалициловая кислота).

Аллергический метод используют в хозяйстве как метод массо­вой диагностики скрытых форм туберкулезного процесса. С этой целью применяют специфические препараты — туберкулин для крупного рогатого скота и отдельно для птиц.

Возбудитель паратуберкулезвого энтерита крупного рогатого ско­та (Mycobacterium paratubercutosis). Вызывает заболевание преиму­щественно у крупного рогатого скота, реже у овец, верблюдов и очень редко у коз и оленей. Паратуберкулез — хроническая ин­фекционная болезнь, характеризующаяся образованием отечно-воспалительных складок слизистого и подслизистого слоя пора­женного участка кишечной стенки под действием локализованно­го здесь возбудителя. Характерные клинические признаки болез­ни — профузный понос и прогрессирующее истощение.

Лабораторная диагностика. При жизни живот­ного посылают фекалии с комочками слизи и примесью крови, со-скобы со слизистой оболочки прямой кишки; посмертно (или при убое) исследуют пораженные участки кишечника, отрезок под­вздошной кишки, перевязанный с двух сторон, мезентериальные лимфатические узлы. Материал берут с соблюдением правил асеп­тики, консервируют в 30%-м растворе глицерина. Для гистологи­ческого исследования консервируют в 10%-м растворе формалина.

Бактериологический анализ. Включает в себя микроскопию мазков из патологического материала и выделение чистой культуры возбудителя паратуберкулеза. Основным ориен­тиром служит результат микроскопирования препаратов, так как выделение чистой культуры возбудителя сопряжено с большими трудностями. Биологическую пробу на паратуберкулез не ставят, т. к. лабораторные животные не восприимчивы. Можно использо­вать телят.

Подготовка материала. Учитывая загрязненность материала посторонней микрофлорой, его предварительно обрабатывают с целью очистки и концентрации возбудителя, как и при диагности­ке туберкулеза, а также применяют способы Венота и Моро или метод флотации.

Метод Венота и Моро: 2...4 г фекалий растирают в стерильной ступке, добавляют 25%-й раствор NaCl до жидкой консистенции и фильтруют через двойной слой марли. Фильтрат сливают в цент­рифужные пробирки, добавляют по 1 мл петролейного эфира (можно бензин или лигроин), взбалтывают, центрифугируют 15...20 мин при 3000 мин-'. Мазки готовят из нижней части надо-садочного слоя жидкости.

Микроскопия. M.paratuberculosis— мелкая палочка дли­ной 0,5... 1,5 мкм и шириной 0,2...0,5 мкм, неподвижная, споры и капсулы не образует, кислотоустойчивая, грамположительная. В препаратах из патологического материала располагается кучками, гнездами, редко одиночно или по 2...4 клетки. Отмечается поли-морфность: палочки могут иметь расширение, приобретая конту­ры бутылки, ручной гранаты, бесструктурных глыбок, мелких кок­ков. В мазках из культуры палочки длиннее, стройнее, скучен­ность меньшая, в некоторых видна зернистость.

В связи с тем что выделение возбудителя паратуберкулеза с фе­калиями происходит периодически, при сомнительном или отри­цательном результате микроскопии исследование повторяют.

Кроме обычной световой используют люминесцентную микро­скопию препаратов-отпечатков из патологического материала или полученной чистой культуры, используя специфические люми-несцирующие сыворотки.

Выделение чистой культуры. Осуществляют по­севом на специальные питательные среды, так как на обычных средах возбудитель паратуберкулеза не растет. Активный рост наблюдают при добавлении к питательным средам вытяжки из уби­тых бактерий туберкулеза или кислотоустойчивых сапрофитов. М. phlei выращивают на среде Данкинса: в 4%-м глицериновом бульо­не растирают 10 мл глицерина и 10 мл печеночного экстракта, ки­пятят, добавляют три свежих яйца, хорошо перемешивают, вносят спиртовой раствор генцианвиолета (2,5 % к общему объему сре­ды), фильтруют, разливают в пробирки, скашивают и стерилизуют в аппарате для свертывания сывороток дробно в течение 3 сут под­ряд при 80°С по 1 ч.

Патологический материал. Предварительно об­рабатывают 5%-м раствором серной кислоты, промывают физио­логическим раствором NaCl, растирают в ступке и высевают на среды. Посевы помешают в термостат при 38 °С; через 2 сут про­бирки парафинируют. Учет производят с помощью лупы через 15 сут, а затем каждые 5 сут. Первичный рост на казеиновой среде наблюдают к 18...20 сут при сильной обсемененности засеянной ткани; при слабой обсемененности — в более поздние сроки. На плотных элективных средах колонии плоские, сухие, серовато-бе­ловатые, с неровными краями. По мере роста края приобретают бугристость, не отличаясь от колоний других микобактерий. В жидких средах (МПБ с глицерином, синтетических средах) на по­верхности образуется нежная беловатая пленка, которая в силу собственной тяжести опускается на дно.

Дифференциация. Возбудитель паратуберкулезного эн­терита дифференцируют от возбудителя туберкулеза по следующим тестам: 1) культивирование микобактерий паратуберкулеза возмож­но только на средах с добавлением «фактора роста»; 2) лаборатор­ные животные невосприимчивы к возбудителю паратуберкулеза.

Серологическая диагностика. Пробы сывороток крови исследуют в РСК по общепринятой методике (с паратуберку-лезным антигеном — метаноловым экстрактом микробной массы М.paraluberculosis); реакция неспецифична. Помимо названных ме­тодов диагностики паратуберкулеза, широко используют аллерги­ческую диагностику в соответствии с действующей инструкцией.

Биопрепараты. Вакцина БЦЖ (BCG): представляет собой живую лиофильно высушенную культуру вакцинного штамма тубер­кулезных микобактерий бычьего типа. Вакцинный штамм BCG (Bacillus Calmette — Guerin) был получен в 1924 г. французскими уче­ными Кальметтом и Гереном путем длительного культивирования (в течение 18 лет) вирулентного штамма М. bovis на картофельно-гли-цериновой среде с добавлением бычьей желчи. Для приготовления противотуберкулезной вакцины штамм БЦЖ выращивают на специ­альных средах в течение 20 сут. В ветеринарной практике вакцину БЦЖ используют в неблагополучных по туберкулезу хозяйствах для профилактики туберкулеза у крупного рогатого скота.

Сухой очищенный туберкулин ППД для млекопитающих гото­вят из культуры микобактерий, которую выращивают в течение двух месяцев, а затем стерилизуют авто планированием. Белок из культуральной жидкости осаждают трихлоруксусной кислотой. Преципитат белка, отделенный центрифугированием, растворяют в воде и вновь осаждают сульфатом аммония. Белок — это основ­ная фракция туберкулина ППД, содержание его составляет 73,4...90 %. Кроме того, в состав препарата входят полисахариды, липиды и нуклеиновые кислоты.

Альттуберкулин (АТК)для млекопитающих: стерильный филь­трат культуры микобактерий, выращенных в течение двух месяцев на мясогидролизатном картофельно-глицериновом бульоне. Буль­он концентрируют, выпаривая до 1/10 первоначального объема, и затем добавляют 20 % экстракта бактериальной массы микобакте­рий.

Туберкулин ППД для птиц: готовят, используя пять штаммов М. avium. Выделение белка из культуральной жидкости и приго­товление препарата проводят, как при получении АТК.