Серологические методы исследования.

В основе всех серологических исследований лежит специфическая реакция между антигенами и антителами.

Антигены — генетически чужеродные вещества, которые при па-рэнтеральном введении в организм животного вызывают ответную ре­акцию в виде сенсибилизации, толерантности и продуцирования ан­тител, взаимодействующих специфически с антителами как in vivo, так и in vitro. Различают антигены корпускулярные, клеточные (бакте­рии, эритроциты) и растворимые (молекулярно-дисперсные). Антиге­ны поливалентны— имеют несколько детерминантных рецепторов для связи с антителами, способны вступать в реакцию с антителами как в организме животного (in vivo), так и вне организма — в пробирке (in vitro). Антигенной функцией обладают не только полноценные ан­тигены, но и неполноценные (гаптены), то есть вещества небелковой природы (полисахариды, липидо-полисахаридный комплекс сомати­ческого антигена микробной клетки и другие вещества).

Антитела — высокомолекулярные специфические белки глобу-линовой фракции сыворотки крови (иммуноглобулины).

По проявлению феномена взаимодействия между антигеном и антителом in vitro различают осадочные реакции, лизирующие и нейтрализующие. Антитела, участвующие в осадочных реакциях, получили названия по типу взаимодействия с антигеном: агглюти­нины — вызывают склеивание корпускулярного антигена и осаж­дение комплекса антиген—антитело (агглютината) и преципити-ны — образуют преципитат с растворимым антигеном. В реакциях лизиса участвуют бактериолизины и гемолизины, обусловливаю­щие лизис, распад корпускулярного антигена. Нейтрализующие антитела обезвреживают, нейтрализуют токсическое действие ан­тигена.

В серологических реакциях, применяемых для диагностичес­ких целей, один из компонентов должен быть известен, по кото­рому ввиду специфичности определяют наличие другого компо­нента. Например, если взять заведомо известный антиген (сапной, бруцеллезный, сальмонеллезный) и с ним исследовать сыворотки крови от животных, то положительный результат реакции с дан­ным антигеном указывает на наличие в сыворотке соответствую­щих антител — то есть сыворотка получена от больного животно­го. И, наоборот, при наличии специфической сыворотки (гиперим­мунная сибиреязвенная, колибактериозная и др.) определяют ви­довую принадлежность (идентифицируют) возбудителя болезни, выделенного из исследуемого материала.

Серологические реакции ставят на физиологическом растворе потому, что реакция между антигенами и антителами происходит в слабоэлектролитной среде.

Реакция агглютинации (ра).

Сущность РА заключается в том, что при добавлении сыворотки крови, содержащей специфичес­кие антигену антитела, в равномерной взвеси клеток происходит их склеивание, образование глыбок, комочков, хлопьев, которые постепенно оседают на дно пробирки, формируя характерный осадок — агглютинат; жидкость над ним просветляется. Характер агглютината зависит от антигенного строения микробной клетки (антигена). Если антигеном является взвесь неподвижных бакте­рий (без жгутиков), имеющих только соматический О-антиген, образуется мелкозернистый осадок в течение 16...22 ч. Если анти­геном служит взвесь бактерий, имеющих жгутики (подвижные виды), и в агглютинации участвует наряду с соматическим еще жгутиковый Н-антиген, формируется крупнохлопчатый, крупно­зернистый агглютинат.

В ветеринарной практике РА используют для диагностики бру­целлеза, сальмонеллезов, колибактериоза, листериоза, вибриоза, лептоспирозов и других заболеваний. Существует несколько методов постановки РА: пробирочный (объемный), капельный (пластинча­тый), кровяно-капельный, гемагглютинации, торможения гемагглю-тинации, антиглобулиновый Кумбса, РА по Кастеллани (метод ад­сорбции агглютининов), кольцевая проба (реакция) с молоком.

Для определения антител (по известному антигену) берут 5... 10 мл крови из яремной вены животного (у свиней из хвостовой) в стерильные пробирки и помещают их в теплое место. Пос­ле образования сгустка осторожно (стерильно!) отделяют его от стенок пробирки, обводя металлической проволокой (вязальной спицей), и ставят в холодное место для ретракции (отделения) сгустка. Сыворотку отсасывают в стерильные пробирки, нумеру­ют их, с нарочным и сопроводительным письмом отсылают в ла­бораторию.

Сыворотки для РА (как и вообще при серологических исследо­ваниях) используют свежие без гемолиза или консервированные фенолом, мертиолатом натрия или борной кислотой. Антиген для РА представляет собой взвесь в физиологическом растворе убитых или живых бактерий. Для диагностических целей рекомендуется стандартный антиген биофабричного производства.

Для идентифицикации бактериальной культуры, выделенной из патологического материала, применяют стандартные сыворот­ки, а антиген готовят из суточной культуры — смыва с МПА. Спе­цифические стандартные агглютинирующие сыворотки получают на биофабриках путем гипериммунизации животных соответству­ющим антигеном (специально подготовленной взвесью живых или убитых микробов, эритроцитами и др.). Готовую сыворотку консервируют, разливают в ампулы и запаивают. Нередко диагно­стические сыворотки подвергают лиофильному высушиванию. Перед употреблением такие сыворотки разводят дистиллирован­ной водой. Но для постановки реакции (и промывания пипеток) ее разводят физиологическим раствором.

Постановка РА классическим (проби­рочным) методом. Исследуемые сыворотки разводят в чистых сухих пробирках с ровным сферическим дном. Для каждой сыворотки берут отдельную пипетку. В зависимости от инфекции производят соответствующие степени разведения сывороток (со­гласно инструкции). Например, для диагностики бруцеллеза сы­воротки разводят 1: 25; 1: 50; 1:100; 1 : 200; 1: 400.

Разведения удобно производить следующим образом. В отдель­ной пробирке готовят основное (исходное) разведение сыворот­ки — 1: 25, смешивая 0,1 мл испытуемой сыворотки с добавлени­ем 2,4 мл физиологического раствора. В опытные пробирки разли­вают по 1 мл физиологического раствора. Затем из исходного раз­ведения 1 мл жидкости переносят в первую опытную пробирку, смешивают с физраствором (разведение 1: 50) и 1 мл переносят во вторую пробирку (1: 100), из второй 1 мл — в третью и т. д. Из последней пробирки 1 мл выливают в сливную чашку, чтобы в каждой пробирке осталось по 1 мл разведенной сыворотки (рис. 44).

Во все пробирки добавляют по две капли стандартного антиге­на (концентрация 10 млрд микробных тел в 1мл), смешивают встряхиванием и выдерживают в термостате 4...6 ч при 37 °С, а за­тем при комнатной температуре 14...16 ч.

При постановке РА (как при каждой серологической реакции) обязательны контроли: в тех же разведениях испытывают сыво­ротку нормальную (от здорового животного) и позитивную (от за­ведомо больного животного или стандартную биофабричного про­изводства) с тем же антигеном.

Компоненты при постановке реакции вносят в пробирки индивидуальными мерными пипетками с резиновыми груша­ми или дозаторами, групповыми дозаторами (рис. 45...47) и автоматическими пипетками с изменяющимися объемами (5...25Омкл).

Рис. 45. Многоканальные пипетки для мнкротнтровання:

/ —оБший вид; 2. а, б, в, г — последовательность работы

Рис. 46. Одиночная автоматическая пипетка:

/ — стеклянный патрубок; 7—расшире­ние для сбора избыточной жидкости; J — резиновая груша; 4 — пипетка-мерник

Рис. 47. Групповая автоматическая пипетка:

/ — стеклянный цилиндр; 2 — отверстие для слива избыточной жидкости; 3— приемник для избыточной жидкости; 4 —отверстия нижней части цилиндра; 5— пипетки-мерни­ки; 6— резиновая груша

Для контроля антигена в 1 мл физиологического раствора до­бавляют две капли антигена для исключения самоагглютинации.

Учет РА осуществляют невооруженным глазом или с помощью агглюти носко па, начиная с контрольных пробирок. Результат РА принято выражать количеством крестов:

++++ (#) —полное просветление жидкости; образовавшийся агглютинат имеет вид перевернутого зонтика, при встряхивании разбивается в глыбки, хлопья разной величины, жидкость остается прозрачной;

+ + +(///) — неполное просветление жидкости; агглютинат, как и в предыдущем опыте, в виде зонтика, при встряхивании раз­бивается на более мелкие глыбки, комочки;

++(++) — неполное просветление жидкости; агглютинат в виде зонтика, но при встряхивании разбивается на хлопья разной величины, жидкость мутная;

+ — наличие небольшого нехарактерного осадка в виде «пугов­ки», жидкость над ним мутная. При встряхивании такой осадок легко разбивается, увеличивая мутность;

— (минус) — вся жидкость мутная, на дне пробирки небольшой осадок антигена с ровными краями в виде «пуговки» и при встря­хивании разбивается в равномерную муть.

РА в 3...4 креста учитывается как положительная степень прояв­ления агглютинации, в два креста — сомнительная, один крест или отсутствие агтлютината — выражает отрицательный результат. Ре­акцию оценивают не только по степени выраженности (++ + +, + + + или + +), но и по высоте титров, то есть степени разведения сывороток, давших положительный результат РА. Например, для ди­агностики бруцеллеза крупных животных диагностическим титром считают положительный результат РА с сывороткой в разведении не ниже 1:100, при сальмонеллезном аборте кобыл — выше 1 : 500.

Капельный (пластинчатый) метод РА. Ис­пользуют для быстрого обследования поголовья животных в лабо­ратории и в условиях хозяйства. На чистую стеклянную пластинку наносят микропипеткой исследуемую сыворотку по 0,04; 0,02; 0,01 и 0,005 мл. К каждой сыворотке добавляют по одной капле антигена определенной концентрации, постепенно смешивают чистой стеклянной палочкой, начиная с наименьшего объема сы­воротки. Условно считают, что сыворотка в первой капле соответ­ствует разведению 1: 50, во второй — 1:100, в третьей — 1: 200, в четвертой — 1: 400. Через 2...3 мин производят учет. Для ускоре­ния реакции стекло слегка подогревают, держа высоко над пламе­нем горелки.

Положительный результат проявляется образованием в капле сыворотки комплекса антиген — антитело в виде крупинок, хло­пьев и просветлением жидкости. При отрицательном результате капля смеси сыворотки и антигена остается равномерно мутной (отсутствие в сыворотке антител).

Пластинчатым методом РА пользуются также для ориентиро­вочного определения вида микроба или его идентификации (ти­пизации). На предметное стекло наносят каплю известной специ­фической сыворотки и отдельно каплю физраствора (для контро­ля). В каждую каплю добавляют культуру испытуемого микроба в количестве, взятом бактериологической петлей, и равномерно размешивают. Положительная реакция указывает на гомологич-ность антигена с известным антителом.

Кровяно-капельный метод РА. Реакцию чаще применяют для диагностики пуллороза (сальмонеллеза птиц) и бруцеллеза. На обезжиренное предметное стекло наносят каплю цельной крови (взятой у птиц из гребешка или сережки), в нее добавляют каплю соответствующего антигена и смешивают стек­лянной палочкой. Для лучшей видимости феномена агглютина­ции биопромышленность выпускает антиген, подкрашенный ге­матоксилином.

В положительных случаях РА (когда в крови присутствуют спе­цифические антигену антитела) через 30...60 с в капле смеси появ­ляются глыбки, хлопья склеенного антигена (агглютинат).

Кольцевая проба (реакция) с молоком. В основном используют при обследовании крупного рогатого скота на бруцеллез и при контроле сборного молока. В агглютинацион-ные пробирки наливают по 2...3 мл свежего цельного молока и до­бавляют антиген (окрашенный гематоксилином) по 0,2 мл (2 кап­ли). Пробирки встряхивают до равномерного окрашивания моло­ка, выдерживают в водяной бане (или термостате) при 37 °С в те­чение 45.60 мин. При наличии в молоке антител образуется комплекс антиген—антитело, который адсорбируется на капель­ках жира и при отстаивании всплывает наверх, образуя синее кольцо в нижнем слое сливок; столбик молока обесцвечивается.

Отрицательная реакция характеризуется синей окраской всего мо­лока в пробирке и слегка желтоватым слоем сливок.

РА методом адсорбции антител (по Кас­те л л а н и). У некоторых микробов наряду со специфическими видовыми антигенами имеются еще групповые, общие с другими видами одного рода или семейства бактерий. При введении в орга­низм животного (и человека) таких бактерий (например, сальмо­нелл) образуются антитела как против видоспецифических, так и групповых (общих для разных видов) антигенов. Если в реакции участвует микроб, обладающий групповым и типовым антигенами, то происходит полная агглютинация общих (групповых) и тииоспе-цифических антигенов, при этом из сыворотки все антитела адсор­бируются. Если антиген не типоспецифичен антителам, происхо­дит реакция агглютинации за счет групповых антигенов и группо­вых антител, типоспецифические антитела в сыворотке остаются.

Адсорбированные групповые антитела удаляют; сыворотки с групповым агглютинатом центрифугируют, а надосадочную жид­кость (сыворотку с оставшимися типоспецифическими антитела­ми) отсасывают и вновь используют в РА. Так как сыворотка, ис­тощенная групповыми антигенами, содержит только специфичес­кие антитела, она будет реагировать положительно лишь со спе­цифическим антигеном. На этом принципе основан метод' получения монорецепторных сывороток.

Реакция Кумбса. В ряде случаев при постановке РА выпадения агглютината не происходит. Одной из причин этого является наличие в сыворотке больных животных наряду с полны­ми антителами так называемых неполных или блокирующих анти­тел, которые тормозят образование агглютината (выпадение комп­лекса антиген—антитело в виде осадка). Методика выявления не­полных антител в организме больного разработана Кумбсом.

Прямая реакция Кумбса (рис. 48) заключается в том, что к эрит­роцитам больного животного добавляют специфическую антигло-булиновую сыворотку (содержащую антитела против глобулинов сыворотки). Эритроциты агглютинируют. При непрямой реакции исследуют сыворотку больного, которую соединяют с эритроцита­ми здорового животного, затем, как и при прямом методе, добав­ляют антиглобулиновую сыворотку. Блокирующие (неполные) ан­титела соединяются с эритроцитами, и добавленная антиглобули-новая сыворотка, вступая в реакцию с неполными антителами, приводит к агглютинации эритроцитов, нагруженных неполными антителами.

Для диагностических целей в ветеринарии разработана удобная модификация методики реакции Кумбса — бактерийный вариант, в котором вместо эритроцитов применяют специфический бакте­рийный антиген.

Бактерийный вариант реакции Кумбса. С исследуемыми сыво­ротками ставят обычную РА. После учета результата реакции в пробирки, в которых отсутствует агглютинация, добавляют по 2 мл физраствора и центрифугируют при 4000 мин~' в течение 15 мин. Надосадочную жидкость удаляют, к осадку добавляют 1 мл антиглобулиновой сыворотки в рабочем титре (установлен пред­варительно). Центрифужные пробирки встряхивают, содержимое переносят в агглютинационные пробирки, ставят их в термостат при 37...38 °С на 16...48 ч, а затем выдерживают еще 1 ч при ком­натной температуре. Учет производят по характеру агглютината, как при обычном методе РА. Реакция Кумбса очень чувствитель­ная и позволяет более точно выявлять больных.

Реакция гемагглютинации (РГ А). Основана на том, что некоторые виды бактерий и вирусов обладают способнос­тью адсорбироваться на поверхности эритроцитов разных видов животных (и птиц), вызывая их склеивание и образование агглю­тината (прямая РГА).

Адсорбция антигена (бактерий, вирусов) на поверхности эрит­роцитов не всегда проявляется образованием видимого осадка; кроме того, РГА неспецифична, потому что эритроциты одного и того же вида животного могут адсорбировать различные антигены.

Специфической является реакция пассивной (непрямой) гемаг­глютинации (РПГА) (рис. 49). Для ее постановки предварительно готовят эритроцитарный диагностикум (эритроциты, на которых адсорбирован антиген). С этой целью стерильно получают кровь

барана (или петуха), дефибринируют ее и несколько раз отмывают в фосфатно-буферном растворе (рН 7,2) при 3...5-кратном цент­рифугировании. Надосадочную жидкость сливают, концентрацию эритроцитов доводят до 2,5 % (1 : 40). К 2,5%-й взвеси эритроци­тов добавляют в равном объеме (по 1 мл или по 0,5 мл) взвесь ис­следуемого вида микроба в концентрации 5...10 млрд клеток в 1 мл. Эритроциты легко адсорбируют антиген полисахаридной природы. Для адсорбции антигена белковой природы эритроциты предварительно обрабатывают танином в разведении 1:20 000. Эритроциты в комплексе с добавленным антигеном оставляют для сенсибилизирования (адсорбции) на 2 ч в термостате (37 °С), за­тем вновь центрифугируют при оборотах З...4тыс. мин""' в течение 5 мин с фосфатно-буферным раствором.

Полученный эритроцитарный диагностикум вносят в пробир­ки (или лунки в плексигласовой доске) и добавляют к нему стан­дартную иммунную сыворотку.

В положительных случаях произойдет РГА — выпадение эрит­роцитов в характерный хлопьевидный или зернистый осадок, рас­пределенный по всей поверхности дна пробирки (гемагглютинат). Значит, исследуемый вид микроба (антиген) специфичен антите­лам иммуносыворотки. В отрицательных случаях несклеенные эритроциты осядут на дно в виде небольшого ровного кружочка.

Для подтверждения достоверности результатов РПГА ставят ре­акцию задержки (торможения) феномена гемагглютинации (РЗГА) или ее модификацию — реакцию нейтрализации антител (РИА).

Рис. 49. Реакция пассивной гемагглютинации (схема):

Эр — эритроциты; АГ— антиген; AT— антитело

Методика постановки РЗГА. Сущность заключается в том, что реакцию агглютинации ставят со специфической диагностической сывороткой и испытуемым антигеном (исследуемый вид микроба используют как антиген). Эту смесь выдерживают 1 ...2 ч при 37 °С,

затем добавляют эритроциты. Если испытуемый антиген гомоло­гичен антителам диагностической сыворотки, они взаимодейству­ют друг с другом и добавленные эритроциты не агглютинируют — результат реакции положительный. Если испытуемый антиген не гомологичен антителам сыворотки или отсутствует в исследуемом материале, добавленные эритроциты адсорбируют антиген и про­исходит РГА —результат РЗГА отрицательный, вид испытуемого микроба (антигена) не установлен,

Методика постановки РНА. Сущность заключается в том, что в равных объемах смешивают диагностическую иммунную сыворот­ку с различными разведениями исследуемого материала (искомого антигена), оставляют для контакта на 1...2ч, затем добавляют эритроциты, сенсибилизированные определенным (известным) антигеном, специфическим по отношению к антителам сыворот­ки (эритроцитарный диагноста кум). Когда искомый антиген всту­пает в реакцию с антителами сыворотки, происходит их нейтрали­зация и добавленные эритроциты не агглютинируют, РГА не про­исходит — результат РНА положительный. Если в исследуемом материале не содержится антиген, специфический к антителам используемой сыворотки, нейтрализации антител не будет; поэто­му при добавлении эритроцитарного диагностикума проявляется агглютинация эритроцитов (гемагглютинация), а результат РНА отрицательный.

Реакция нейтрализации антител — высокочувствительный ме­тод обнаружения антигена не только во взвеси живых (или уби­тых) бактерий, но и во взвеси растертой ткани различных органов, нативных и гретых секретах и экскретах больного организма.