Иммуноферментный метод.

Предназначен для выявления и идентификации микрорганизмов и антител к ним. Различают две разновидности иммуноферментного метода: гомогенный и гетеро­генный.

Гетерогенный метод (иммуносорбентный ELISA-тест) и РЭМА —реакция энзиммеченых антител (или антигенов), адсор­бированных на поверхности водонерастворимых полимеразных материалов. При гомогенном иммуноферментном методе не ис­пользуется твердая фаза; предназначен в основном для определе­ния низкомолекулярных антигенов (гормонов, лекарственных препаратов).

Основные компоненты для твердофазного иммуноферментно­го метода:

1. Специфические иммуноглобулины (выделяют из гипериммунной сыворотки осаждением сульфатом аммония с последую­щей очисткой).

2. Антивидовые глобулины (выделяют из гипериммунной сыворотки осаждением сульфатом аммония с последующей очистой).

3. Белок А (выделяют из золотистого стафилококка) или бычий сывороточный альбумин.

4. Антиген (готовят из органов зараженных животных). Заведомо положительные или отрицательные антигены.

5. Фермент пероксидаза (выделяют из хрена).

6. Конъюгаты (пероксидаза, связанная с антителом или антигеном методом периодатного окисления).

7. Субстратная смесь (5-аминосалициловая кислота и пероксид водорода или ортофенилендиамин и пероксид водорода).

8. Детергент (поверхностно-активные вещества: твин-20, -80, тритон Х-100, сорбитальс-20).

9. Иммунологический планшет (планшет из прозрачного полистирола).

10. Шприц-дозатор (для внесения ингредиентов реакции). Существуют прямой и непрямой методы постановки реакции.

На практике в основном используют непрямой метод.

Определение антигена иммуноферментным методом. Перед по­становкой реакции лиофилизированные компоненты растворяют в объеме, указанном на этикетке, 0,01 М раствором фосфатного буфера или дистиллированной водой и доводят до объема рабочих разведений. Объем компонентов, вносимых поэтапно в лунки планшета, равен между собой и составляет 0,1 мл.Этапы постановки реакции:

1. Сенсибилизация планшета. В лунки планшета вносят специфические антитела (иммуноглобулины) в рабочем разведении, указанном на этикетке. Планшет с антителами инкубируют в термостате 3 ч при 37 "С или 18 ч при 4 °С. По окончании инкубации планшеты промывают раствором фосфатного буфера с твином (ФБТ) 3...4 раза, предварительно встряхнув содержимое лунок. Остатки раствора удаляют постукиванием о фильтроваль­ную бумагу.

2. Внесение антигенов. В лунки планшета, сенсибилизированные специфическими антителами, вносят контрольные положи­тельный и отрицательный антигены и исследуемую пробу в разве­дениях от 1:10 до 1:1280 и инкубируют в термостате 1 ч при 37 °С. По истечении срока инкубации проводят трехкратную от­мывку лунок планшета от несвязавшихся с антителом антигенов и подсушивают на фильтровальной бумаге.

3. Внесение пероксидазного антивидового конъюгата в разведеия с целью выявления комплекса антиген + антитело. Залитые планшеты помещают на 1 ч в термостат при 37 "С. Затем лунки трехкратно отмывают раствором ФБТ и подсушивают.

4. Внесение субстратной смеси. Для проявления реакции в лун­ки планшета вносят раствор субстрата (индикатора пероксидазы) — ортофенилдиамина, к раствору которого добавляют 3%-й раствор пероксида водорода для выявления комплекса антиген + + антитело + конъюгат. Планшеты закрывают и оставляют в тем­ ном месте при комнатной температуре на 15...30 мин.

5. Учет реакции проводят визуально или спектрофотометрически. При визуальной оценке реакцию учитывают по числу крестов: ++++ —-интенсивное окрашивание;

+++ — оранжевое окрашивание;

++ — бледно-оранжевое окрашивание;

+ — желтое окрашивание.

Пробу считают положительной при оценке в два креста и бо­лее. За титр антигена принимают наивысшее разведение, при ко­тором в реакции со специфическим антителом наблюдается блед­но-оранжевое окрашивание (++), значительно превосходящее по интенсивности окрашивание контрольных лунок планшета.

При спектрофотометрическом учете результатов реакции про­изводят расчет коэффициента специфичности, который равен от­ношению оптической плотности (ОП) продукта реакции в лунках с контрольным положительным антигеном (ОП1) к оптической плотности субстратной смеси в лунках с контрольным отрица­тельным антигеном (ОП2). Реакцию считают положительной, если коэффициент специфичности не ниже 2,1, и отрицательной, если ниже 2,1.

Техника постановки иммуноферментного метода для обнару­жения (или титрования) антител выполняется так же, как при об­наружении и идентификации микробного антигена, с той разни­цей, что материалом служит исследуемая сыворотка крови.