Тема 11. Изучение неспецифической резистентности организма и серологические методы диагностики инфекционных болезней

Неспецифические реакции организма. Защи­ту макроорганизма от возбудителей инфекционных болезней обеспечивает не только иммунная система, но и неспецифические механизмы — непроницаемость слизистых и кожных покровов, фагоцитоз, бактерицидное действие лизоцима, а также гумораль­ные факторы — комплемент, пропердин и др.

Количественное определение лизоцима в сыворотке крови.

Лизо-цим — гидролитический фермент, расщепляющий высокомолеку­лярные полисахариды бактерий (пептидогликан), находится в тка­нях, секретах, экскретах (за исключением пота и мочи), действуя бактерицидно на многие бактерии. Присутствие и активность ли-

зоцима определяют по его способности вызывать лизис бактерии Micrococcus lysodeicticus.

Готовят 1%-й агаровый гель (Дифко) на 1/15 М фосфатно-со-левом буферном растворе (ФСБР). В расплавленный агар при тем­пературе 6О...7О°С вносят ацетоновый порошок биомассы М. lysodeicticus из расчета 10 мг на 100 мл геля. Компоненты переме­шивают и разливают в чашки Петри (толщина слоя 4 мм). В зас­тывшем агаре делают лунки диаметром 5 мм.

Параллельно определяют активность стандартного лизоцима, кристаллизованного из яичного белка. Для этого лизоцим разво­дят в 1/15 М ФСБР, чтобы получить разведения с концентрацией 0,5, 1, 3, 5, 10, 20, 40 и 70 мг/мл. Затем по 0,05 мл каждого разведе­ния лизоцима вносят в лунки. Чашки Петри выдерживают 48 ч во влажной камере при 37 "С и измеряют диаметр зоны лизиса М. lysodeicticus вокруг лунок.

Далее на основании полученных данных строят калибровочную кривую, откладывая на осях координат значения концентрации лизоцима и диаметра зоны лизиса. Сыворотку крови разводят в ФСБР в соотношении 1: 5, вносят по 0,03 мл в лунки и далее по­ступают, как при определении активности стандартного лизоци­ма. Измерив диаметр зоны лизиса, по калибровочной кривой вы­числяют содержание лизоцима в исследуемой пробе.

Количественное определение комплемента в сыворотке крови.

Комплемент (С) представляет собой сложную систему главным образом неактивных белков крови. Процесс их активации (по классическому пути) запускается образованием комплекса анти­ген—антитело (АГ—AT) и происходит в виде цепной реакции: комплекс Ar + AT + Ci+C4 + C₂ + C₃ + C₅ + C₆ + C₇ + C₈ + C₉. В

процессе активации образуется литический комплекс, который делает мембрану клетки проницаемой; внутрь клетки осмотически поступает вода, в результате клетка набухает и лопается. Такое разрушение клеток (антигенов) под влиянием антител и компле­мента получило название иммунного лизиса. Наиболее эффективно комплемент действует на бактериальные клетки в сочетании с ли-зоцимом. Кроме того, бактериальные клетки (антигены) после взаимодействия с антителами и комплементом легче поглощаются фагоцитами.

Количество комплемента в крови (сыворотке крови) определя­ют в реакции иммунного лизиса с использованием эритроцитов барана и гемолизина в качестве антител к эритроцитам барана. Эритроциты барана, обработанные гомологичными антителами и чувствительные в таком состоянии к литическому действию комп­лемента, называют гемолитической системой. Количество компле­мента измеряют в 50%-х гемолитических единицах (СН₅₀). За еди­ницу комплемента принимают такое его количество в объеме 0,5 мл, которое за 30 мин при 37 °С обусловливает лизис 50 % эритроцитов в 0,5 мл гемолитической системы (5%-я суспензия эритроцитов барана в веронал-мединаловом буферном растворе с рН 7,3...7,4+ гемолизин в тройном титре).

Исследуемую сыворотку в возрастающих дозах разливают по пробиркам (например, 0,02; 0,03; 0,04; 0,05; 0,08; 0,1мл), добавляют ФСБР до 0,5 мл и вносят во все пробирки по 0,5 мл стандартизированной гемсистемы. Одновременно ставят конт­роль на резистентность эритроцитов (0,5 мл ФСБР + 0,5 мл ге-мосистемы). Пробирки встряхивают и выдерживают 30 мин при 37 °С, охлаждают 10 мин при 2...4 X, центрифугируют 15...20 мин при оборотах 3000 мин"¹. Насадочную жидкость колориметрируют и по коэффициенту экстинкции определяют процент гемолиза при помощи заранее построенной калибро­вочной кривой.

Калибровочную кривую строят следующим образом: к 1 мл 5%-й суспензии эритроцитов добавляют 3 мл дистиллированной воды, эритроциты при этом полностью лизируются (100%-й гемолиз). Из полученного лизата путем добавления буферного раствора го­товят пробы с 10-, 20-, 30-, 40-, 50-, 60-, 70-, 80-, 90%-м гемоли­зом. На фотоэлектроколориметре определяют оптическую плот­ность каждой пробы (кювета шириной 1 мм, синий светофильтр), затем на оси абсцисс откладывают процент гемолиза, а на оси ор­динат—коэффициент экстинкции. СН₅₀ вычисляют по дозе сы­воротки, дающей гемолиз, наиболее близкий к 50 %. Для этого ис­пользуют специальную формулу (Крога) или, что проще, коэффи­циенты, рассчитанные по этой формуле. Например, если исследу­емая сыворотка в разведении 1:25 дает 30%-й лизис, то СН₅о в 1 мл составит 25 — 0,844 = 21,1 ед.