37. Транскрипція, трансляція і реплікація мікровірусів.

Бактеріофаг φХ174 є представником фагів з одноланцюговою ДНК. Вірусний геном є кільцевим і складається з 5 386 нуклеотидів. Його позначають (+), тому що цей ланцюг є матрицею для синтезу комплементарного (-)-ланцюга. ДНК містить гени для синтезу 11 генних продуктів. Для генома фага фХ174 характерне явище перекривання генів, коли одна генна послідовність кодує більше, ніж один білок.

Протягом інфікування фаг φХ174адсорбується на ліпополісахариді зовнішньої мембрани клітинної стінки бактерій і проникає у клітину. „Роздягання" вірусу супроводжується реплі-кацією вірусного генома. Одноланцюговий ДНК-геном фХ174 після проникнення в клітину перетворюється у дволанцюгову ре-плікативну форму ДНК Генетична карта бактеріофага фХ174 Реплікативна форма є замкненою, суперспіралізованою, дволанцюговою кільцевою ДНК. В її утворенні беруть участь РНК-праймаза, ДНК-поліме раза, лігаза і гіраза - клітинно-кодуючі білки, задіяні в перетворенні ДНК фага в реплікативну форму. У фага φХ174 реплікація починається з одного або багатьох специфічних ініціюючих сайтів в одноланцюговій кільцевій ДНК. РНК-праймаза синтезує короткий РНК-праймер для ініціації реплікації цієї ДНК. ДНК-реплікація відбувається в замкненій, кільцевій ДНК, формуючи повну дволанцюгову реплікативну форму. ДНК-реплікація відбувається напівконсервативним шляхом. Реплікативну форму ДНК використовють для синтезу фагової мРНК. Фагова мРНК починає синтезуватися на декількох промоторах на реплікативній формі і термінується декількома сайтами. Полігенна мРНК транслює різні фагові білки, включаючи А-білок, який бере участь у формуванні одноланцюгових ДНК-геномів для фагового потомства. Формування одноланцюгового фагового потомства починається з розрізання одноланцюгового фагового плюс-ланцюга реплікативної форми біля точки огі, що каталізується А-білком. А-білок ріже і лігує два кінці щойно синтезованого ланцюга для утворення кільцевої одно-ланцюгової ДНК. Після утворення одноланцюгової ДНК і продукування кап-сидного білка, новий фаг збирається. Лізис клітини-господаря відбувається тоді, коли виходить фагове покоління. У фага φХ174 описаний цікавий механізм лізису інфікованих клітин. Продукт гена Е цього фага (всього у нього дев'ять генів, деякі з них перекриваються) контролює включення активності бактеріальних автокаталітичних ферментів. Стимулюючий цим фагом лізис пригнічується за певних концентрацій МgSО₄ середовища, або якщо клітини перед інфікуванням були вирощені при рН більше 7,4. Така специфічність у реакції клітини може бути використана як чинник запобігання фаголізису на виробництві.

38. Транскрипція, трансляція і реплікація сіфовірусів.

Siphoviridae – родина бактерійних фагів з дволанцюговою лінійною ДНК, що належить до порядку Caudovirales (Caudo: від латинського cauda, «хвіст»). Фаги з хвостовими відростками, лінійними дволанцюговими молекулами ДНК. Sipho: від грецького siphon, «трубка», відповідно до довгого хвостового відростка не здатного до скорочення. Реплікація цих вірусів, як і у всіх ДНК-вмісних вірусів, йде безпосередньо за участю ДНК-залежної ДНК-полімерази без залучення посередника – РНК. Одним з найвідоміших представників цієї родини є фаг лямда Ентеробактерій.

Фаг λ: помірний бактеріофаг Escherichia coli. Модельний організм генетики,молекулярної біології та біології бактеріофагів. У життєвому циклі фаг лямбда повинен зробити один великий «вибір» — яким шляхом йому розвиватись: літичним, чи лізигенним.. Віріон фага λ складається із ікосаедричної голівки діаметром близько 50 нм та хвостового відростка довжиною близько 150 нм, на кінці якого розміщені бокові нитки довжиною 85 нм. Загалом, до складубілкової оболонки фага входить близько п'ятнадцяти білків, що кодуються вірусним геномом.

Лізогенний розвиток:

Вірусна ДНК вбудовується у бактерійну хромосому, перетворюючи таку клітину на лізогенну (тобто таку, що за певних умов може стати причиною лізису інших клітин у культурі). Після цього із всього вірусного геному експресується тільки один ген — білка репресора, який пригнічує роботу решти генів. Під час кожного циклу реплікації бактерійної ДНК реплікується і профаг, і кожна дочірна клітина отримує свою копію. У такому стані бактеріофаг лямбда може перебувати необмежений час. Лізогенізація клітини має ще один наслідок: через те, що в її цитоплазмі завжди є певний рівень білка репресора, вона не може повторно інфікуватись фагом того ж типу.

Літичний розвиток:

Адсорбція фага λ на поверхні клітини відбувається завдяки взаємодії білка на кінчику хвостового відростка та поверхневого білка LamB бактерії. Після успішного приєднання фаг вводить свою лінійну ДНК у цитоплазму клітини живителя, де вона замикається у кільце: між комплементарними нуклеотидами «липких кінців» утворюються водневі зв'язки, а однониткові розриви «зашиваються» ДНК-лігазами.

Експресія ранніх генів:

Наступною подією в циклі розвитку фага λ є розпізнавання його «ранніх» промоторів P_R (правого) та P_L (лівого) РНК-полімеразами живителя, які розпочинають транскрипцію. Утворені транскрипти зовсім короткі. Продукт гену N працює як антитермінатор: разом із чотирма бактерійними білками він зв'язується із РНК-полімеразою і модифікує її таким чином, що вона набуває здатності проходити термінаторні ділянки і продовжувати транскрипцію. Відбувається експресія всіх генів, що входять до складу ранніх оперонів, найважливішими з них є O та P, які забезпечують реплікацію ДНК.

Спочатку реплікація ДНК відбувається за θ-механізмом (двокерункова реплікація), який забезпечує утворення кільцевих молекул ДНК. Приблизно на 12 хвилину механізм змінюється на «кільце, що котиться», внаслідок чого синтезуються довгі лінійні молекули, що складаються із великої кількості послідовно сполучених копій вірусного геному. Такі молекули називаються конкатамерами і є підходящим субстратом для пакування у фагові голівки.

Експресія пізніх генів:

Пізня транскрипція розпочинається зі промотора P_R' пізнього оперона. Цей промотор належить до сильних, тому РНК-полімерази приєднуються до нього відразу після потрапляння вірусної ДНК в клітину, проте транскрипція відразу ж і припиняється, оскільки безпосередньо за P_R' міститься термінаторна ділянка.

Голівки і хвостики збираються окремо в цитоплазмі клітини живителя. У кожну голівку запаковується по одній копії вірусного геному, які відрізаються від конкатамеру в cos ділянці, внаслідок чого формуються «липкі кінці». Після цього голівки та хвостики з'єднуються, формуючи зрілі інфекційні вірусні частинки, що накопичуються у цитоплазмі. фермент ендолізин розщеплює муреїн клітинної стінки кишкової палички. Позбавлена опори клітинної стінки бактерія розривається від осмотичного шоку, а вірусні частинки виходять у середовище, готові інфікувати нові клітини.