98) Загальнофізіологічні чинники противірусного імунітету.

Першим механічним бар'єром на шляху проникнення вірусів у організм є непошкоджена шкіра та слизові оболонки верхніх дихальних шляхів, шлунково-кишкового тракту, очей і статевих органів. Кисле середовище вмісту шлунка згубно впливає на різні віруси, передусім із суперкапсидною оболонкою. Виражену інактивуючу дію на деякі віруси має жовч, зокрема щодо збудників чуми ВРХ та інфекційної анемії коней.

Подолавши шкірні й слизові бар'єри, віруси проникають у найближчі тканини, де розвивається місцеве запальне вогнище. Там створюється багато несприятливих умов - локальне підвищення температури, ацидоз, гіпоксія, що призводить до пригнічення репродукції вірусів.

Важливе значення в противірусному імунітеті має підвищення температури тіла. Наприклад, утримання кролів при +39...+40°С попереджує їхню загибель від вірулентного штаму вірусу міксоми. І навпаки, низька температура навколишнього середовища ускладнює перебіг інфекції, спричиненої атенуйованим вакцинним штамом цього збудника

Виділення вірусу з інфікованого організму з калом, сечею, носовим слизом, слиною, молоком та іншими секретами й екскретами теж має певне значення в противірусному імунітеті. Посилення секреторно-видільної функції багатьох клітинних систем позитивно впливає на відновлення гомеостазу, порушеного інфекцією.

Чинники противірусного імунітету знаходяться під регулювальним впливом двох антагоністично діючих гормонів - кортизону і соматотропіну. Кортизон знижує інтенсивність запальної й фагоцитарної реакцій, пригнічує продукування антитіл та інтерферону, сповільнює очищення крові від вірусів. Соматотропін, навпаки, стимулює запальний процес, посилює активність плазматичних клітин, які виробляють антитіла.

Взаємозв'язок клітинних і гуморальних чинників противірусного імунітету проявляється на різних стадіях імунної відповіді.

Дія клітинних і гуморальних чинників противірусного імунітету знаходиться під впливом загальнофізіологічних реакцій організму. Наприклад, місцеве підвищення температури, ацидоз і гіпоксія сприяють інактивації вірусів у первинному вогнищі інфекції. Пропасниця, виділення збудника із секретами й екскретами мають суттєвий вплив на процеси імуногенезу. Дезінтеграція вірусів і звільнення від них організму не відбувається без участі ферментів, які розщеплюють вірусні нуклеїнові кислоти та білки.

99) Експериментальні методи оцінки антивірусних препаратів.

На сьогодні не існує єдиної уніфікованої схеми експериментальної оцінки антивірусної активності препаратів. Первинний відбір складається з двох етапів, перший з яких - це дослідження in vitro. Наступний етап включає дослідження in vivo – на лабораторних тваринах.

Дослідження препаратів на культурі клітин починається з порівняльної оцінки його цитотоксичності та антивірусної дії. Перспективними є препарати, які проявляють антивірусну активність в концентраціях, нетоксичних для клітин. Дослідження бляшок (детермінація цитопатичного ефекту) є чи не найбільш поширеним методом з цієї серії.

Для позначення антивірусної дії препарату застосовуються показники:

1) МІК (мінімальна інгібуюча концентрація) - концентрація антивірусного препарату, яка знижує на 50% число клітин з вірусспецифічними включеннями чи скупченнями вірусного антигену,

2) ЕД50 (50% ефективна доза) - позначають концентрацію антивірусного препарату, в якій він знижує кількість бляшок чи розвиток ЦПД в інфікованій оброленій культурі на 50%.

Для дослідження антивірусної активності препаратів in vitro застосовуються такі методи.

1) Цитопатична дія. Цей метод застосовується для вірусів (міксо-, параміксо-, покс-, герпес-, адено- та ін.), які проявляють чіткий цитопатичний ефект в перевивних та первиннотрипсинізованих культурах клітин людського та тваринного походження.

2) Метод редукції бляшок. досліджуваним вірусом інокулюють моношар чутливих клітин. Моношар покривають різними концентраціями досліджуваного препарату в напіврідкому поживному середовищі (для запобігання міжклітинного розповсюдження вірусу). Кількість бляшок підраховують за допомогою світлового мікроскопу. Редукція утворення бляшок пов'язана з інгібуванням вірусу та чисельно виражається як ІС50 та ІС95.

3) Метод флюоресціюючих антитіл. передбачає виявлення окремих вірус-інфікованих клітин, що містять вірусний антиген. Застосовують як прямий, так і непрямий варіанти методу флюоресціюючих антитіл (МФА). Прямий - реєстрація інтенсивості свічення антигену в інфікованих клітинах. Непрямий - підрахунок кількості інфікованих (тих, що світяться) та неінфікованих (%) клітин в присутності препарату та без нього.

4) Тестування антивірусної активності препаратів за допомогою індикаторних клітинних ліній. Індикаторна клітинна лінія - Vero-ICP10-EGFP, була зконструйована шляхом стабільної трансформації клітин Vero за допомогою плазміди, що кодує GFP. Через 6 годин після інокуляції інфіковані клітини стають помітними при їх вивчені за допомогою флюоресцентного мікроскопу. Інтенсивність флюоресценції залежить від титру інокульованого вірусу.

5) Потокова цитометрія. клітини або ядра поодинці перетинають зфокусований світловий пучок. Світло певної довжини хвилі збуджує молекули флюоресціюючих бавників, зв'язаних з різними клітинними компонентами, при цьому може відбуватись збудження декількох різних барвників, що дозволяє одразу оцінити декілька клітинних параметрів. Світлові сигнали детектуються. Швидкий, кількісний метод оцінки багатьох параметрів флюоресціюючих клітин. В умовах in vitro використовують мічені флюорохромом моноклональні або поліклональні антитіла, направлені проти певних антигенів. Застосовують для тестування ефективності антивірусних препаратів ганцикловіру та фоскарнету, ацикловіру.

6) Реакція гемаглютинації. Застосовується для оцінки активності сполук проти тих вірусів, які мають гемаглютинуючу активність (ортоміксо-, параміксо- та тогавіруси).

7) Реакція гемадсорбції. Здатність клітин, заражених вірусом, адсорбувати на своїй поверхні еритроцити(ортоміксо- та параміксовірусів). Інгібуючий ефект препаратів оцінюють по зменшенню кількості гемадсорбованих клітин в порівнянні з контролем.

8) Імуноферментний аналіз. Застосовують для первинного відбору антивірусних препаратів, визначення ефективних концентрацій, а також впливу на утворення інфекційного вірусу. ІФА широко застосовується для відбору препаратів з антиВІЛ-активністю.

9)Електроннна мікроскопія. Проводиться на більш пізніх етапах дослідження механізмів антивірусної активності препаратів. Найефективніша є імунна електронна мікроскопія, яка дозволяє виявляти появу ранніх антигенів, а також антигенів на клітинній поверхні і вірусспецифічних рецепторних структур.

10) Масс-спектрометрія. Це метод дослідження речовин шляхом визначення мас атомів та молекул, що входять до його складу, та їх кількості. Перевагами даного методу є висока селективність, чутливість та точність.Досліджуваний матеріал переводиться в газоподібний стан, іонізується та розділяється в магнітному полі. Висока абсолютна чутливість матеріалу (~10-13г).