7 . Рабочие калибровочные растворы для определения калия в эритроцитах

Основной ка­либровочный раствор КС1, мл	Дистилли­рованная вода, мл	Концентрация калия
		в калибровочной пробе			в эритроцитах
		мг%	ммоль/л	мг%		ммоль/л
1,0	До 100	1,0	0,256	260		66,6
1,1	»	1,1	0,282	286		73,3
1,2	»	1,2	0,307	312		80,0
1,3	»	1,3	0,333	338		86,0
1,4	»	1,4	0,359	364		93,0
1,5	»	1,5	0,384	390		100,0
1,6	»	1,6	0,412	416		106,6

NaCl о сновные калибровоч­ные растворы, мл

14 14 14 14 14 14

K₂S0₄

0,4 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5

До 100

Дистилли­рованная вода, мл

Концентрация калия и натрия в биологической жидкости, ммоль/л, равна СК, где С — концентрация калия (натрия) в ммо-лях, найденная по калибровочному графику; К — разведение био­логической жидкости.

Клиническое значение. Нормативы содержания калия и натрия в крови здоровых взрослых животных приведены в приложении 5. У собак, кошек и овец содержание калия в эритро­цитах в 2,5—3 раза выше, чем в плазме, у большинства моногаст-ричных животных — в 20 раз и более.

Концентрация калия в плазме крови новорожденных животных несколько выше, чем у взрослых. Натрий в основном внеклеточ­ный элемент, более 80 % его находится во внеклеточном про­странстве. Однако у собак и жвачных животных содержание его в эритроцитах преобладает над калием, у остальных животных — на­оборот.

Натрий имеет основное значение в поддержании осмотического давления внеклеточной жидкости, является важным компонентом буферных систем, играет важную роль в поддержании жизнеде­ятельности микрофлоры рубца.

Изменение концентрации натрия и калия в крови вызывает на­рушение кислотно-щелочного равновесия. Потеря натрия в орга­низме сопровождается дегидратацией. Установлено, что при уменьшении содержания натрия до 115—130 ммоль/л, когда осмо­тическая концентрация понижается до 250—280 ммоль/л, развива­ется тяжелое состояние. Уменьшение или увеличение количества натрия в организме сопровождается подобным изменением содер­жания в нем воды, поэтому обессоливание и обезвоживание почти всегда понимают как синонимы.

Снижение количества натрия в плазме крови отмечают при дли­тельном солевом голодании, поступлении с кормом большого ко­личества калия, заболеваниях почек, сопровождающихся потерей натрия, чрезмерном потоотделении, сахарном диабете, поносах, обильном поении, недостаточности коры надпочечников, регидра-тации организма большим количеством жидкости, не содержащей натрия. Гипонатриемия может наблюдаться при лихорадочном со­стоянии, пневмониях, хроническом нефрите.

Повышение содержания натрия в плазме крови наблюдают при повышенном диурезе, ограничении питья, несахарном диабете, поносе без возмещения жидкости, недостатке калия, гиперфунк­ции коры надпочечников и др. Усиленное выделение натрия с мо­чой бывает при нефрите.

Снижение количества калия в крови (гипокалиемия) отмечается при усиленном выделении его с мочой (гиперфункция коры над­почечников и передней доли гипофиза), при диарее, больших внутривенных и внутрибрюшных вливаниях жидкости, не содер­жащей калия. Уровень содержания калия в крови и тканях не всег­да тождествен: при уменьшении количества калия в тканях уро­вень этого элемента в крови может быть высоким. Такое явление бывает при сгущении крови, когда наступает относительная гипер-калиемия.

Гипокалиемия часто наблюдается при токсикозах у новорож­денных животных, тяжелых формах диспепсии, сопровождаемых выраженным ацидозом. Снижение калия в крови наблюдается при сахарном диабете, введении инсулина, больших количеств раство­ров глюкозы, поваренной соли.

Гиперкалиемия наблюдается при поедании большого количества молодой травы или зеленой массы растений, выращенных на обильно удобренных калийными удобрениями угодьях, т. е. при пастбищной тетании. Она может быть следствием ацидоза, когда водородные ионы переходят из плазмы в клетки, обмениваясь на калий. Повышение калия в крови может быть следствием пораже­ния почек, которые не могут выводить все поступающие с кормом электролиты.

Примечания. 1. Ведущие изготовители пламенных фотометров — фирмы «Radiometer» (Дания), выпускает анализато­ры FLM3 и FLM3-0, и instrumentation Laboratay» (США), производит прибор IL-943. Эти приборы позволяют проводить измерения сыворотки, плазмы и мочи. Фирмы производят калибровочные раство­ры с нулевым и стандартным содержанием электро­литов (обычно 140 ммоль/л натрия и 5,0 ммоль/л калия), с помощью которых проводится настройка и ' калибровка прибора. 2. Для определения натрия можно использовать гепарин, не содержащий на­трий. Следует избегать гемолиза, поскольку разру­шение эритроцитов вызывает выход из них калия и приводит к завышению результатов.

Источники: 50, 52.

Определение натрия и калия в биологических жидкостях с ис­пользованием ионоселективных анализаторов. В настоящее время в связи с производством ионоселективных электродов появились со­зданные на их основе ионоселективные анализаторы, позволяю­щие определять натрий и калий в биологических субстратах.

В России ионоселективный анализатор натрия и калия ЭЦ-59 выпускает фирма «Юнимед». Зарубежные фирмы «Radiometer» (Дания), «Nova bimedicab и «Вестап-Couter» (США), «AVL» (Авс­трия) и многие другие производят ионометры, предназначенные для измерения концентрации натрия и калия в биологических жидкостях. Анализаторы выгодно отличаются от пламенных фото­метров компактностью, бесшумной работой, безопасностью (не используется горючий газ), быстродействием (анализ проводится в течение 30—90 с), наличием автоматической самокалибровки че­рез определенные интервалы времени. Фирмы выпускают различ­ные модификации анализаторов газов крови со встроенными в них ионоселективными электродами для определения содержания на­трия, калия, ионизированного кальция и хлоридов в одной пробе одновременно.

Определение натрия, калия и других элементов на ионоселек­тивных анализаторах или ионометрах проводят по инструкциям, прилагаемым к соответствующему прибору. Принцип их работы общий. Электрическая схема состоит из индикаторного ионосе-лективного чувствительного к определенному иону электрода, электрода сравнения, прибора для измерения электродвижущей силы анализируемого раствора.

Если в раствор, содержащий ионы, поместить соответствующий индикаторный электрод, на его поверхности возникает электри­ческий потенциал. Для измерения величины его в исследуемый раствор помещают электрод сравнения, потенциал которого не ме­няется, для чего электрод сравнения заполняют электролитом (раствором соли) постоянного состава. Для обеспечения контакта электролита с анализируемым раствором используют пористую мембрану. Разность потенциалов индикаторного электрода и элек­трода сравнения отражает активность исследуемого иона. Для сис­темы, в которой ионная сила раствора поддерживается относи­тельно постоянной, активность определенного иона соответствует его концентрации. При измерении содержания иона, принимаю­щего участие в реакции на поверхности индикаторного электрода, меняется электродвижущая сила цепи.

Источник: 28.

Методы определения кальция, фосфора, магния. Для оценки состояния минерального и водно-элект­ролитного обменов проводят определение в крови общего и иони­зированного кальция, неорганического фосфора и магния, а также используют показатели активности щелочной фосфатазы, парат­гормона, кальцитонина и других веществ, непосредственно свя­занных с минеральным обменом.

Определение общего кальция в сыворотке крови комплексоно-метрическим методом с индикатором флуорексоном (по Вичеву, Ка-ракашеву). Принцип. Использование флуорексона для комп-лексонометрического определения кальция основано на том, что его водные растворы в сильно щелочной среде не флуоресцируют, но в этих же условиях флуорексон образует с кальцием флуорес­цирующие комплексы.

Комплекс индикатора с металлом менее прочен, чем комплекс металла с трилоном Б, поэтому по мере добавления трилона Б к раствору, содержащему металл и индикатор, ионы металла посто­янно переходят к трилону Б. При титровании трилоном Б в точке эквивалентности отмечается резкое «затухание» флуоресценции.

Реактивы: 0,1 н. раствор трилона Б (ЭДТА). Готовят из стандарт-титра;

0,005 н. раствор трилона Б. Готовят из 0,1 н. раствора трилона Б: 10 мл 0,1 н. раствора трилона Б в мерной колбе доводят дистил­лированной водой до 200 мл. Устойчив 2 мес;

индикаторная смесь: индикатор флуорексон (ч. д. а.) и калий хлорид (ч. д. а., х. ч.) в соотношении 1 : 100;

1 н. раствор калия гидроксида (ч. д. а., х. ч.). Допускается при­месь кальция не более 1 мг%;

стандартный 100 мг%-ный раствор кальция: 2,497 г кальция кар­боната (х. ч.), высушенного до постоянной массы при 100—120 "С, вносят в мерную колбу на 1 л, добавляют 3 мл концентрированной соляной кислоты и после растворения соли доводят объем бидистил-лированной водой до метки. 1 мл раствора содержит 1 мг кальция;

рабочий 10 мг%-ный раствор кальция. Готовят разведением 100 мг%-ного раствора кальция дистиллированной водой 1 : 10 (1 мл 100 мг%-ного раствора кальция и 9 мл воды). Рабочий рас­твор кальция необходим для установления «затухания» флуорес­ценции при титровании и контрольной проверке метода.

Оборудование: микробюретка емкостью на 2 мл с гра­дуировкой на 0,01 мл, оканчивающаяся вытянутым капилляром с оттянутым концом, что дает возможность проводить титрование меньшими каплями; пипетки емкостью на 1 и 10 мл; стаканчики для титрации (лучше полистироловые).

Посуду перед использованием выдерживают в разведенных раство­рах трилона Б и многократно промывают бидистиллированной водой.

Ход определения. В стаканчик вносят 20 мл дистил­лированной воды, 5 мл раствора калия гидроксида и несколько кристалликов индикаторной смеси. Появляется флуоресценция, обусловленная присутствием в приготовленной смеси кальция.

Для связывания кальция в смесь из микробюретки добавляют по каплям раствор трилона Б до исчезновения флуоресценции и появления бледно-розового окрашивания. Обычно для этого тре­буется одна капля раствора трилона Б. Большее количество свиде­тельствует о высокой концентрации кальция в растворе калия гид­роксида и его непригодности для анализа. Примесь кальция в растворе может быть обусловлена некачественной подготовкой посуды или неисправностью дистиллятора.

После связывания кальция, находящегося в растворе натрия гидроксида, в этот же стаканчик добавляют 0,5 мл сыворотки кро­ви и снова оттитровывают раствором трилона Б до исчезновения флуоресценции и появления бледно-розового окрашивания.

Расчет ведут по формуле Са = а • 20, где а — количество рас­твора трилона Б, пошедшее на титрование сыворотки крови, мг%; 20 — коэффициент для пересчета в мл при условии, что титр 0,005 н. раствора трилона Б равен 1. Для перевода мг% в ммоль/л полученную величину делят на 4 или в качестве коэффициента берут не 20, а 5. Примечания. Используют сыворотку, свободную от гемолиза, ли-пемии, не желтушную. Венозную кровь отстаивают при комнатной температуре в течение 30—60 мин до полного образования сгустка или помещают в тер­мостат при 37 "С на 30—60 мин. В закрытой про­бирке сыворотку можно хранить 7 дней при тем­пературе 4—5 °С. Ложнозавышенные результаты вызывают билирубин и ионы меди в методах тит­рования с ЭДТА, корковые пробки, гемоглобин, липемия, оксалаты. Определение общего кальция в сыворотке крови комплексоном Арсеназо III. Принцип. Арсеназо III — металлокомплексон из группы диазокомплексообразователей, которые имеют неоди­наковое сродство к различным ионам металлов. Наибольшее сродство проявляется к ионам Th, UO|~, Zr, Pu, меньшее — к ио­нам Ва, Са, Sr. Из этих ионов в сыворотке крови в значительном количестве присутствует только ион Са. При смешивании раствора Арсеназо III и сыворотки крови образуется комплекс кальция с Ар­сеназо III, который характеризуется поглощением излучения с мак­симумом 650—670 нм. Интенсивность поглощения прямо пропорци­ональна концентрации кальция в диапазоне 0,5—3,5 ммоль/л. Реактивы: Арсеназо III (ч. д. а.); натрия додецилсульфат (ч.); ледяная уксусная кислота (х. ч.); натрия ацетат (ч. д. а.); кальция карбонат безводный (ч. д. а.); соляная кислота (ч. д. а.).

Рабочие растворы реактивов: 0,1 моль/л ацетатный буфер с рН 4,75. Для приготовления 1 л буфера смешивают 454 мл 0,1 моль/л уксусной кислоты и 500 мл 0,1 моль/л натрия ацетата трехводного. Для приготовления 0,1 моль/л уксусной кислоты 2,86 мл кислоты (d = 1,05 г/см , 17,5 н.) вносят в мерную колбу на 500 мл и доводят объем до метки дистиллированной водой. Для приготовления 0,1 моль/л раствора натрия ацетата трехводного

6,8 г соли растворяют дистиллированной водой в стаканчике, за­тем переносят в мерную колбу на 500 мл и доводят объем до метки дистиллированной водой;

стандартный 2,5 ммоль/л раствор кальция: 25 мг кальция угле­кислого безводного (ч. д. а.) в мерной колбе на 100 мл растворяют 5 мл 0,1 н. соляной кислоты (готовят из фиксанала) и доводят объ­ем до метки дистиллированной водой;

рабочий реактив Арсеназо III; 0,3 ммоль/л Арсеназо III в 0,1 моль/л ацетатном буфере с рН 4,75. Для приготовления 250 мл рабочего реактива 62 мг Арсеназо III растворяют в 250 мл ацетат­ного буфера, к полученному раствору добавляют 250 мг натрия до-децилсульфата (до 0,1 %).

Оборудование: фотоэлектроколориметр; пробирки по­листироловые; пипетки вместимостью 0,1 и 5 мл.

Ход определения. К5мл рабочего реактива Арсеназо III добавляют 50 мкл сыворотки (соотношение 1 : 100), смешива­ют, избегая образования пены. Через 2 мин и позже измеряют оп­тическую плотность образцов сыворотки крови против рабочего реактива Арсеназо III в кювете с толщиной слоя жидкости 10 мм при длине волны 590 нм. Параллельно готовят стандартную пробу аналогично опытной, но вместо сыворотки добавляют 50 мкл стан­дартного раствора кальция с содержанием 2,5 ммоль/л.

Концентрацию кальция (Са, ммоль/л) в сыворотке крови рас­считывают по формуле

Са= §= -2,5,

где Е_оп — экстинкция опытной пробы; — экстинкция стандартной пробы; 2,5 — коэффициент для пересчета в ммоль/л.

Примечания. 1. Исследуемая сыворотка не должна содержать следов гемолиза, алиментарной гиперлипидемии. 2. Исследование сыворотки крови проводят в те­чение первых суток после получения при хране­нии при температуре не более 4 °С. 3. Посуда для определения кальция должна быть химически чистой. Желательно использовать не стеклянную, а полистироловую посуду. Источник: метод изложен в описании А. И. Овсянникова, С. А. Конькова, В. К. Гуркало. Измерение содержания кальция в сыворотке крови и других биологических жидкостях комплексоном Арсеназо III [( Клиническая лабораторная диагностика. — Киев, 1999, № 1. — С. 16—18 с изменениями, внесенными М. Л. Лизогу-бом, Н. Н. Куевдой (Крымский АТУ)]. В описанную методику вне­сены следующие изменения: концентрация Арсеназо III увеличена до 0,3 ммоль/л вместо 0,15 ммоль/л; в качестве детергента исполь­зован натрия додецилсульфат, концентрация которого 0,1 % вмес­то 0,04 %; определение кальция проводилось в сыворотке крови животных.

Определение общего кальция в сыворотке крови с индикатором мурексидом. Принцип. Мурексид в щелочной среде образует с кальцием непрочное соединение розового цвета. При добавлении к раствору трилона Б образуется стойкое комплексное соединение, розовый цвет переходит в фиолетовый.

Реактивы: 0,005 н. раствор трилона Б (готовят из стан­дарт-титра или из 0,1 н. раствора трилона Б): 10 мл 0,1 н. раствора трилона Б в мерной колбе доводят дистиллированной водой до 200 мл. Устойчив 2 мес;

2 н. раствор натрия гидроксида. 80 г NaOH (ч. д. а., х. ч.) рас­творяют в 1 л дистиллированной воды;

мурексид (ч. д. а., х. ч.) свежеприготовленный раствор индика­тора: 10 мг на 20 мл воды;

кальция карбонат безводный (ч. д. а., х. ч.). Стандартный 2,5 моль/л (10 мг%) раствор: 25 мг вещества растворяют в мерной колбе на 100 мл. Пригоден для исследования кальция в крови живот­ных, кроме яйценосной птицы. При исследовании крови кур и другой яйценосной птицы необходимо подготовить 3,8 ммоль/л (15,2 мг%) раствор: 38 мг вещества растворить в мерной колбе на 100 мл.

Оборудование: стаканчики вместимостью 50 мл (лучше полистироловые); микробюретка на 2 мл с оттянутым концом; пи­петки.

Ход определения. Стандартная проба: в стаканчик вно­сят 10 мл дистиллированной воды, 0,2 мл 2 н. раствора щелочи, 0,5 мл раствора кальция карбоната с содержанием 10 мг% кальция и 3 капли свежеприготовленного раствора мурексида. Раствор ок­рашивается в слабо-розовый цвет. Осторожно титруют раствором трилона Б до появления слабо-фиолетового цвета. Записывают ре­зультат.

Проба с сывороткой крови: в стаканчик вносят 10 мл воды, 0,2 мл раствора щелочи, 0,5 мл сыворотки крови и 3 капли раство­ра мурексида. Появляется слабо-розовое окрашивание. Затем тит­руют раствором трилона Б до появления слабо-фиолетового цвета, идентичного стандартной пробе.

Расчет ведут по формуле

где х — количество кальция, ммоль/л; А — количество раствора трилона Б, пошедшего на титрование образца сыворотки крови, мл; Б — количество раствора, пошедшего на титрования стандарта, мл; 2,5 — коэффициент для перевода в ммоль/л.

Если исчисление кальция идет в мг%, то за коэффициент берут величину 10. При исследовании сыворотки кур-несушек, когда в качестве стандарта взят раствор 3,8 ммоль/л (15,2 мг%), коэффи­циентами будут величины 3,8 или 15,2.

(Описанная методика апробирована на кафедре терапии и кли­нической диагностики Крымского государственного агротехноло-гического университета.)

Определение кальция в костной ткани. Предварительно прово­дят озоление кости. Кость освобождают от мышц, сухожилий, свя­зок и взвешивают. У трубчатых костей отпиливают суставные кон­цы (эпифизы). Каждый из трех частей (два эпифиза и диафиз) рас­пиливают вдоль и поперек на 4 части. Для анализа берут примерно 1/2—1/4 часть массы диафиза и эпифиза. Масса навески зависит от размера кости, но всегда нужно брать одинаковый процент массы каждой части, предназначенной для анализа.

Отобранный материал тщательно дробят и 10—15 г помещают в предварительно прокаленный и взвешенный до постоянной мас­сы большой тигель. Кость обугливают, для чего тигель ставят на электроплитку с асбестовой сеткой (в вытяжном шкафу) и нагре­вают до тех пор, пока кость не перестанет дымить. Затем тигель помещают в муфельную печь и прокаливают при темно-красном накаливании (450—500 °С) в течении 4—5 ч. Зола после сжигания должна быть светло-серого или белого цвета без примесей час­тиц угля. После остывания тигель переносят в эксикатор, взве­шивают на тех же аналитических весах и вновь ставят в муфель­ную печь на 1—2 ч, затем снова взвешивают. Разница между пер­вым и вторым взвешиваниями не должна превышать 0,0002 г. При необходимости можно рассчитать содержание сырой золы (х) по формуле

_₌ (Л-Д)-ЮО Я '

где А — масса тигля с золой, г; В — масса тигля, г; 100 — коэффициент для пересчета в проценты; Н — навеска, г.

Содержимое тигля переносят в фарфоровую ступку, измель­чают в однородную массу. На аналитических весах взвешивают 1 г зольного остатка (лучше в ранее прокаленном и взвешенном тигле). Взятую навеску в том же тигле растворяют в 10 мл 25%-ного раствора соляной кислоты при постоянном перемеши­вании стеклянной палочкой. Полученный раствор переносят в мерную колбу на 250 мл, тигель несколько раз обмывают дистил­лированной водой, которую сливают в ту же колбу, объем ее до­водят до метки дистиллированной водой. Содержимое колбы хо­рошо перемешивают и после отстаивания проводят анализ, как описано в методике определения общего кальция в сыворотке крови.

Источник: 21.

Определение ионизированного кальция расчетным методом (по Й. Тодорову). Ионизированный кальций определяют вычислением по формуле

0,2+ ₌ 6Са-Д/3 Б+ 6 '

где Са²⁺ — ионизированный кальций, мг%; Са — общий кальций, мг%; £ — общий белок, г%.

Для вычисления ионизированного кальция необходимо знать количество общего кальция и общего белка сыворотки крови. Источник: 68.

Определение ионизированного кальция с применением обменной адсорбции (по Д. Т. Волкову). В качестве адсорбента используют нейтральный алюминия оксид, стандартизированный по Брохма-ну, II степени активности. Ионизированный кальций устанавлива­ют по разнице между общим кальцием и кальцием, не вступившим в ионный обмен. Последний определяют следующим образом: бе­рут 2,5 мл плазмы (сыворотки) крови, добавляют 50 мг адсорбента из расчета 20 мг алюминия оксида на 1 мл плазмы (сыворотки) крови. Содержимое пробирки тщательно перемешивают стеклян­ной палочкой и центрифугируют 5 мин при 3000 мин . Надоса-дочный раствор осторожно сливают в пробирку, не допуская взму­чивания осадка. Затем определяют содержание кальция в 0,1 мл полученного раствора по вышеописанной методике определения общего кальция. В плазме крови концентрация ионизированного кальция ниже, чем в цельной крови и сыворотке.

Источник: 12.

Примечание. В качестве антикоагулянта используют гепарин.

Са²⁺ стабилен в цельной крови при 4—8 "С в гер­метически закрытых шприцах в течение 2 ч. Не допускается контакт крови с воздухом.

Для измерения содержания ионизированного кальция крови и мочи используются ионоселективные анализаторы, которые про­изводят зарубежные фирмы «Radiometer» (Дания), «Novabimedical» и «Весктап-Conlter» (США), «AVL» (Австрия).

Клиническое значение. В крови циркулирует каль­ций в трех формах: 45—50 % находится в ионизированном состоя­нии, 40—45 % связано с белками, остальное количество образует комплексы с различными моно- и бивалетными низкомолекулярны­ми анионами. Физиологически активен ионизированный кальций.

Уровень общего кальция в крови определяется суммой ионизи­рованного связанного с белками крови и различными анионами кальция. Определения только общего кальция для характеристики нарушений метаболизма недостаточно.

Преимущественно кальций — внеклеточный элемент. Около 99 % его находится в костной ткани в составе гидрооксиапатита, остальное количество — во внеклеточной жидкости.

Кальций — один из важнейших компонентов системы, регули­рующей проницаемость мембран. Его ионы способствуют взаимо­действию актина и миозина, т. е. сокращению мышечных волокон. Это осуществляется с участием магния и АТФ. В нервно-мышеч­ных синапсах ионы кальция способствуют выделению ацетилхоли-на и связыванию его с холин-рецептором, а при избытке ацетил-холина активизируют холинэстеразу, расщепляющую ацетилхо-лин. Ион кальция активизирует процесс свертывания крови.

Всасывание, транспортировка, распределение в тканях и выде­ление кальция протекают с участием активных форм витамина D и паратгормона.

Уровень кальция в крови здоровых животных указан в прило­жениях 5 и 6. Он зависит от содержания кальция, фосфора и вита­мина А в рационе, состояния гормональной системы, желудоч­но-кишечного тракта, почек, печени и других органов.

Снижение содержания кальция в крови отмечается при длитель­ном недостаточном поступлении его с кормом, плохом усвоении вследствие дефицита витамина D и паратгормона, которые обеспе­чивают его всасывание в кишечнике и препятствуют выведению с мочой. Гипокальциемия сопровождает алиментарную остеодист-рофию, рахит, вторичную остеодистрофию и многие другие болезни. Уровень кальция в крови стабильно удерживается длительное время за счет мобилизации его из костной ткани. Компенсаторные меха­низмы проявляются при развитии алиментарной остеодистрофии и рахита, при которых низкое количество кальция в крови обнаружи­вают при затяжном, тяжелом течении патологического процесса.

Снижение уровня кальция в крови при вторичной остеодистро­фии связано, вероятно, с гипофункцией околощитовидных желез и недостаточным синтезом паратгормона.

Резко выраженную гипокальциемию наблюдают при послеро­довом парезе. Объясняется такое явление, очевидно, гиперсекре­цией кальцитонина, вырабатываемого С-клетками щитовидной железы, который в противоположность паратгормону способствует минерализации кости и понижает уровень кальция в крови.

Причиной гипокальциемии может быть гипофункция около­щитовидных желез. Так как кальций участвует в нервно-мышеч­ном возбуждении, то при его резком снижении появляются тони­ческие, клонические судороги и парезы.

Гипокальциемия возможна при гломерулонефрите, интерсти-циальном нефрите, когда наступает гипопротеинемия, а следова­тельно, потеря связанного с белком кальция; при остром панкреа­тите из-за избытка глюкогона; опухоли щитовидной железы в свя­зи с избыточной продукцией кальцитонина.

Повышение содержания кальция в крови может быть при передо­зировке витамина D, гиперфункции паращитовидных желез, дли­тельном применении антоцидов при язвенной болезни.

Определение неорганического фосфора в сыворотке крови с ва-надат-молибденовым реактивом (по Пулсу в модификации В. Ф. Коромыслова и Л. А. Кудрявцевой). Принцип. Фосфор в безбелковом фильтрате дает лимонно-желтое окрашивание с вана-

дат-молибденовым реактивом. Степень окраски измеряют на фо-тоэлектроколориметре.

Реактивы: 20%-ный раствор трихлоруксусной кислоты;

реактив на фосфор. Готовят его смешиванием 500 мл 0,234%-ного раствора аммония ванадата, 1000 мл 2,5 н. (2,5 моль/л) раствора со­ляной кислоты и 1000 мл 3,53%-ного раствора молибденовокислого аммония. 0,234%-ный раствор аммония ванадата готовят путем растворения 2,34 г вещества в 500 мл горячей дистиллированной воды, добавляют 28,0 мл концентрированной соляной кислоты плотностью 1,19, охлаждают до 20 °С и доводят до 1 л дистиллиро­ванной водой. Для получения 3,53%-ного раствора молибденово­кислого аммония 35,3 г соли растворяют в 700 мл дистиллирован­ной воды, затем все количество переносят в мерную колбу на 1 л и дистиллированной водой доводят до метки. 2,5 моль/л раствор соля­ной кислоты готовят путем доведения 207,5 мл концентрированной соляной кислоты до 1 л дистиллированной водой. Реактив на фос­фор хранят в склянке из темного стекла не более 2 мес;

основной стандартный раствор фосфора. 4,394 г однозамещен-ного фосфорнокислого калия (КН2РО4 х. ч., ч. д. а.), высушенного до постоянной массы в эксикаторе над концентрированной серной кислотой, растворяют в 1 л дистиллированной воды. 1 мл раствора содержит 1 мг фосфора;

5 мг%-ный рабочий стандартный раствор фосфора. 5 мл основ­ного стандартного раствора фосфора доводят в мерной колбе на 100 мл дистиллированной водой до метки.

Оборудование: фотоэлектроколориметр; колбы кони­ческие термостойкие на 1 л; колбы мерные на 50, 100, 500, 1000 мл; электроплитка; пипетки; пробирки; центрифуга.

Ход определения. В центрифужную пробирку вносят 2,5 мл дистиллированной воды, 0,5 мл сыворотки, 2 мл раствора трихлоруксусной кислоты, перемешивают и через 10 мин центри­фугируют 15 мин при 3000 мин^-1. С помощью шприца и пипетки, не затрагивая осадка, берут 2,5 мл центрифугата, добавляют 2,5 мл реактива на фосфор, перемешивают и через 10 мин колориметрируют на ФЭКе с синим светофильтром в кювете с толщиной слоя 1 см против дистиллированной воды. Параллельно готовят стандартную пробу: к 0,5 мл рабочего стандарта 5 мг%-ного раствора фосфора до­бавляют 2,5 мл дистиллированной воды и 2 мл раствора трихлорук­сусной кислоты, смешивают. Затем берут 2,5 мл этого раствора, вно­сят в пробирку, добавляют 2,5 мл реактива на фосфор и через 10 мин колориметрируют в том же режиме, что и пробу сыворотки.

Расчет ведут по формуле

х = (А/Б) ■ 5,

где х—количество фосфора, содержащегося в 100 мл сыворотки, мг; А — экстинкция испытуемого образца; Б — экстинкция стандартного раствора; 5 — коэффициент для перевода в мг%.

Для выражения содержания фосфора в ммоль/л в качестве ко­эффициента берут 1,615 или величину в мг% умножают на 0,323 (приложение 4).

Примечание. Сыворотка должна быть отделена от эритроцитов не позже чем через 1 ч после взятия крови. Она должна быть свободна от гемолиза, липемии, жел-тушности. Допустимо хранение сыворотки или плазмы в течение 1 сут при комнатной температу­ре, 4 сут при — 4—8 °С. Клиническое значение. Фосфор — один из основных структурных элементов организма. Все виды обмена в организме неразрывно связаны с превращением фосфорной кислоты. Фос­фор входит в структуру нуклеиновых кислот, благодаря фосфори-лированию осуществляется кишечная адсорбция, гликолиз, пря­мое окисление углеводов, транспорт липидов, обмен аминокислот и т. д. Макроэргические фосфорные соединения, среди которых центральное место занимает АТФ, — универсальные донаторы и аккумуляторы энергии. 80—85 % фосфора содержится в скелете. В крови он присутствует в неорганической и в органической фор­мах. Органический фосфор связан с белками и липидами. Всего в крови животного и человека содержится около 10 фракций фос­форных соединений.

В клинической практике диагностическое значение имеет неор­ганический фосфор. Нормативы содержания его в сыворотке (плаз­ме) крови здоровых животных приведены в приложениях 5 и 6.

Снижение уровня фосфора в крови отмечается при длительном недостатке его в рационе, плохом усвоении, при расстройствах же­лудочно-кишечного тракта или дефиците витамина D, при гипер­функции паращитовидных желез и гипофункции щитовидной же­лезы, когда увеличивается секреция паратгормона и уменьшается выработка кальцитонина. Отмечается оно и при алиментарной осте-одистрофии, рахите, уровской болезни, пеллагре, длительном лече­нии инсулином, кальция хлоридом, болезнях желудочно-кишечно­го тракта.

Повышение уровня фосфора в крови может быть вызвано умень­шением секреции паратгормона, когда тормозится реабсорбция фосфора в почках. Увеличение кальцитонина стимулирует реаб-сорбцию фосфора в почках и приводит к гиперфосфатемии.

Гиперфосфатемия встречается при сердечной недостаточности, кетозе, приеме больших доз витамина D, нефрите, нефрозе, ток­сикозах беременности, мышечном перенапряжении. У телят мо­лочного периода содержание фосфора в крови несколько выше, чем у взрослых животных. Содержание фосфора в безбелковом фильтрате цельной крови, плазмы и сыворотки, обработанных од­новременно, одинаково.

Определение неорганического фосфора в сыворотке кровн жи­вотных с аскорбиновой кислотой. Принцип. В безбелковом центрифугате неорганический фосфор реагирует с молибденовой кислотой с образованием фосфорно-молибденовой кислоты, кото­рая восстанавливается аскорбиновой кислотой до синего фосфор-но-молибденового комплекса. Интенсивность окраски пропорци­ональна концентрации неорганического фосфора.

Реактивы: хлорная кислота — 20 мл;

50%-ный раствор трихлоруксусной кислоты (ТХУ) — 100 мл (флакон № 1);

5%-ный раствор молибдената аммония — 100 мл (флакон № 2); аскорбиновая кислота — 1 г (флакон № 3); основной стандартный раствор фосфора — 100 мг% (ампула); 1 н. соляная кислота — 10 мл.

Подготовка рабочих растворов. 10%-ныйраствор ТХУ: содержимое флакона № 1 переносят в колбу на 500 мл и дово­дят объем дистиллированной водой до метки. Можно приготовить 100 мл: 20 мл 50%-ного раствора ТХУ в колбе на 100 мл довести дис­тиллированной водой до метки. В случае появления мутности раствор фильтруется.

5%-ный раствор молибдената аммония (флакон № 2) готов к применению.

0,1 н. раствор соляной кислоты: содержимое флакона (10 мл) 1 н. соляной кислоты переносят в мерную колбу на 100 мл и дово­дят дистиллированной водой до метки.

Раствор аскорбиновой кислоты: содержимое флакона № 3 рас­творяют в 100 мл 0,1 н. раствора соляной кислоты. Раствор готовят перед использованием.

Рабочий калибровочный (стандартный) раствор фосфора: в мерную колбу на 100 мл вносят 5 мл (ампула) основного калибро­вочного раствора фосфора и доводят объем дистиллированной во­дой до метки. Получают 5 мг%-ный (50 мг/л) раствор фосфора.

Ход определения. Опытная проба. В центрифужную пробирку вносят 2,5 мл дистиллированной воды, 0,5 мл сыворотки крови и 3 мл 10%-ного раствора ТХУ. Перемешивают стеклянной палочкой. Через 10 мин центрифугируют 20 мин при 3000 мин Осторожно с помощью шприца отбирают 3 мл центрифугата, до­бавляют 0,6 мл раствора молибдената аммония, 0,12 мл раствора аскорбиновой кислоты и 1,3 мл дистиллированной воды. Переме­шивают и через 20 мин колориметрируют в кювете с толщиной слоя 1 см при красном светофильтре (630—690 нм) против контроля.

Контроль. К 3 мл 10%-ного раствора ТХУ добавляют 0,6 мл рас­твора молибдената аммония, 0,12 мл раствора аскорбиновой кис­лоты, 1,3 мл дистиллированной воды.

Калибровочный раствор. Перемешивают 2,5 мл дистиллированной воды, 0,5 мл 5 мг%-ного раствора фосфора, 3 мл 10%-ного раствора ТХУ. Через 30 мин 3 мл этой смеси переносят в другую пробирку, до­бавляют 0,6 мл раствора молибдената аммония, 0,12 мл раствора ас­

г

корбиновой кислоты, 1,3 мл дистиллированной воды. Через 20 мин колориметрируют при тех же условиях, что и опытную пробу. Расчет ведут по формуле

де х — количество неорганического фосфора, мг/100 мл; Е_оп — экстинкция опытной пробы; Е_ст — экстинкция 5 мг/100 мл раствора фосфора; 5 — коэффициент для перевода в мг/100 мл (мг%).

При переводе мг% в ммоль полученную величину умножают на 0,323.

Источник: 27.

Определение магния в сыворотке (плазме) крови по цветной ре­акции с титановым желтым (по Кункелю, Пирсону, Швейгерту в модификации И. В. Петрухина). Принцип. Магний реагирует с титановым желтым в щелочной среде с образованием окрашен­ных соединений. Интенсивность окраски пропорциональна кон­центрации магния.

Р е а к т и в ы: 20 %-ный раствор трихлоруксусной кислоты (ТХУ);

0,01%-ный раствор титанового желтого. Готовят в день опреде­ления;

0,02%-ный раствор поливинилового спирта;

основной стандартный раствор магния. Растворяют 8,458 г маг­ния хлорида (MgCl2 • 6 Н₂0) в дистиллированной воде и доводят до 1 л в мерной колбе: 1 мл раствора содержит 1 мг магния (100 мг%). Можно готовить 0,01 н. раствор магния сульфата из стандарт-титра (фиксанала), который содержит 12,15% магния;

рабочий стандартный раствор с содержанием 2 мг% магния. Бе­рут 1 мл основного раствора магния хлорида с содержанием 100 мг% и доводят в мерной колбе дистиллированной водой до 50 мл. При использовании в качестве основного раствора 0,01 н. раствора магния сульфата его разводят 1 : 6 (1 мл раствора с содер­жанием 12,15 мг% магния + 5 мл дистиллированной воды) и полу­чают раствор с содержанием 2,02 мг% магния;

2 н. (2 моль/л) раствор натрия гидроксида. 80 г натрия гидрок­сида растворяют в мерной колбе и доводят дистиллированной во­дой до 1 л.

Оборудование: фотоэлектроколориметр; центрифуга; пробирки центрифужные.

Ход определения. В центрифужную пробирку вносят 1 мл сыворотки (плазмы), 1 мл раствора ТХУ, тщательно переме­шивают стеклянной палочкой и через 10 мин центрифугируют при 5000 мин^-1 в течение 15 мин или при 3000 мин^-1 в течение 20 мин. Над осадочная жидкость должна быть прозрачной. С помощью шпри­ца и пипетки, на затрагивая осадка, берут 0,5 мл прозрачного цент-рифугата, добавляют 1 мл раствора титанового желтого, 1 мл раствора поливинилового спирта и 2 мл натрия гидроксида, перемешивают.

Таким же образом готовят стандартную пробу. В пробирку вно­сят 1 мл стандартного рабочего раствора магния (2 мг%), 1 мл ТХУ, перемешивают. К 0,5 мл этой смеси добавляют 1 мл раствора ти­танового желтого, 1 мл раствора поливинилового спирта и 2 мл раствора натрия гидроксида, смешивают.

Параллельно готовят контроль на реактивы. В пробирку вносят 1 мл дистиллированной воды, 1 мл раствора ТХУ, 1 мл раствора титанового желтого, 2 мл раствора поливинилового спирта и 2 мл раствора натрия гидроксида, перемешивают. Через 10 мин опыт­ную и стандартную пробы колориметрируют в кювете с толщиной слоя 1 см при длине волны 500—600 нм (зеленый светофильтр) против контроля на реактивы.

Расчет ведут по формуле

где х— количество магния, мг%; А — экстинкция опытной пробы; Б — экстинкция стандартного рабочего раствора магния; 2 — коэффициент для пересчета в мг%.

При использовании стандартного раствора с содержанием 2,02 мг% магния в качестве коэффициента используют эту величи­ну. При расчете содержания магния в ммоль/л в качестве коэффи­циента берут 0,822 при содержании в стандартном растворе 2 мг% магния или 0,830 при содержании в стандартном растворе 2,02 мг% магния. При переводе мг% в ммоль/л полученную вели­чину умножают на 0,411 (см. приложение 4).

Источники: 29, 76.

Примечание. Самым точным и чувствительным методом опреде­ления общего кальция и общего магния в биоло­гических жидкостях считается атомная абсорбци­онная спектрофотометрия.

Клиническое значение. Циркулирующий в крови магний существует в трех формах: около 55 % находится в ионизиро­ванной биологически активной форме; от 12 до 15 % образует комп­лексы с низкомолекулярными анионами; от 30 до 33 % связано с бел­ками крови. Около 25 % магния взаимодействует с альбуминами и около 8 % — с глобулинами. Концентрация магния в клетках в 10—15 раз выше, чем во внеклеточной жидкости. Метаболическая роль магния определяется его участием как кофактора более чем в 300 экзиматических реакциях. Магний практически участвует во всех обменных процессах организма. Ионы магния активируют АТФ-фа-зу, обеспечивают работу К—Na-насоса клеточных мембран. Магний и кальций в различных тканях могут действовать и как синергисты, и как антагонисты. В гладких мышцах сосудов миокарда отмечают их антагонизм. В то же время дефицит как магния, так и кальция повы­шает нервно-мышечную возбудимость. Магний усиливает расщепле­ние ацетилхолина путем активации холинэстеразы.

При снижении уровня магния в крови увеличивается концентра­ция ацетилхолина, достигая предельной величины, при которой блокируется передача нервного возбуждения, наступают тетания и судороги. Магний тесно связан с обменом кальция, фосфора и ка­лия. Более 50 % его находится в костях и зубах.

Гипомагниемию отмечают при диарее, полиурической стадии острой почечной недостаточности вследствие потери магния с ка­лом или мочой, при циррозе печени, гиперпаратиреозе, гипоти­реозе, хроническом панкреатите, усиленной лактации.

Снижение содержания магния в крови бывает при пастбищной тетании, алиментарной остеодистрофий, послеродовом парезе, транспортной болезни у коров. Гипомагниемия наступает вследс­твие поступления в организм избытка калия (с молодой травой) или азота с концентрированными кормами, а также азотсодержа­щими небелковыми средствами.

3.3.4. МЕТОДЫ ОЦЕНКИ СОСТОЯНИЯ БЕЛКОВОГО ОБМЕНА

Для оценки состояния белкового обмена, а также функций от­дельных органов проводят определение в сыворотке крови общего белка и его фракций, мочевины, креатинина и других составляю­щих остаточного азота.

Для определения общего белка сыворотки крови используют методы сжигания (къельдалеметрические), рефрактометрические, спектрофотометрические и др. В лабораториях ветеринарной ме­дицины преимущественно пользуются рефрактометрическим и ко­лориметрическим (биуретовым) методами. При определении бел­ковых фракций сыворотки крови используют электрофоретиче-ские (на агаровом геле, в полиакриламидном геле, на бумаге, ацетате целлюлозы), турбидиметрические (высаливание нейтраль­ными солями), седиментационные (разделение белков на фракции ультрацентрифугированием) методы и др.

В клинической практике для разделения белков пользуются ча­ще электрофоретическими и турбидиметрическими методами. При электрофорезе на бумаге получают 5 основных фракций: альбуми­ны, cq-, ct2, Р- и у-глобулины. Недостатки этого метода — длитель­ность проведения анализа (результаты исследования можно получить только на 2—3-й день), не совсем четкое разделение фракций белков. Электрофорезом на агаровом геле получают более четкое разделение белковых фракций, чем на бумаге, однако сложность процедуры при­готовления геля не позволяет широко внедрять этот метод в лабора­торную практику. С помощью электрофореза на полиакриламидном геле можно получать около 30 фракций белка. Недостаток метода — трудность количественной оценки полученных фракций.

Унифицированным признан метод электрофореза на ацетате целлюлозы. При отсутствии в лаборатории аппарата для электро­фореза используются методы осаждения белков нейтральными со­лями с последующим турбидиметрическим измерением степени помутнения среды на ФЭКе. Соотношение альбуминов и глобули­нов в сыворотке крови определяют белково-осадочными пробами (сулемовой, с цинк-сульфатом, тимоловой и др.).

Под остаточным азотом понимают количество его, которое ос­тается в крови после осаждения белков. Сюда входит азот мочеви­ны, аминокислот, креатинина, креатина, мочевой кислоты, инди-кана, аммиака, полипептидов, нуклеотидов, биогенных аминов и других продуктов белкового обмена. Основная часть остаточного азота крови — азот мочевины, на долю которого приходится не ме­нее 1/2 всего небелкового азота крови.

Около 1 /4 остаточного азота составляет азот аминокислот, кре­атина и креатинина. Наибольшее клиническое значение имеет оп­ределение отдельных фракций остаточного азота, в частности мо­чевины, аминного азота, креатина и креатинина, мочевой кисло­ты, индикана.

Для определения мочевины в крови, моче и других биологиче­ских жидкостях применяют диацетилмонооксимные, уреазные, ги-похлоритные, гипобромидные, ксантгидроловые и другие методы. Наиболее распространенным является колориметрический метод, основанный на взаимодействии мочевины с диацетилмоноокси-мом с образованием окрашенных продуктов (реакция Фирона). Однако более точными и специфическими являются методы опре­деления мочевины с использованием фермента уреазы.

Для определения белка, альбумина, мочевины, креатинина, а также других биохимических показателей возможно применение отражательных фотометров и диагностических полосок системы «сухой химии», биохимических автоанализаторов. Пробирки для взятия крови не должны содержать детергенты и другие моющие средства. Хранят их закрытыми.

Определение общего белка в сыворотке крови рефрактометриче­ским методом. Принцип. В основу рефрактометрических ме­тодов анализа положено определение показателя (коэффициента) преломления исследуемого вещества — отношения синуса угла па­дения луча света к синусу угла его преломления. В сыворотке кро­ви величина рефракции в первую очередь зависит от количества белков.

Реактив: смесь этилового спирта с эфиром 1:1.

Оборудование: рефрактометры ИРФ-4546, УРЛ, RL и др.

Ход определения. Устанавливают прибор на нуль по дистиллированной воде при температуре 20 "С. Предварительно верхнюю и нижнюю камеры протирают марлевой салфеткой, смо­ченной смесью спирта с эфиром, и насухо — ватным тампоном. Поверхность призм при установке прибора на нуль и исследова­нии образца сыворотки крови должна быть чистой и сухой, от это­го во многом зависит результат анализа.

Окуляр шкалы коэффициентов преломления ставят в крайнее положение на себя. Опускают нижнюю половину камеры, на при­зму наносят 1—2 капли дистиллированной воды. Камеру закрыва­ют, окуляр шкалы и окуляр зрительной трубы устанавливают на резкость. Дисперсию в окуляре зрительной трубы устраняют вра­щением винта лимба дисперсии.

Линию окуляра шкалы устанавливают на цифру 1,3330 (показа­тель преломления воды) и в зрительную трубу наблюдают границу светотени по отношению к точке пересечения двух взаимно пер­пендикулярных линий. Если граница светотени проходит через точку пересечения линий, то прибор установлен на нуль. Если это­го нет, то при помощи ключа и маленького винта на корпусе зри­тельной трубы ставят границы светотени на точку пересечения ли­ний. Поверхность призм досуха вытирают мягкой марлевой сал­феткой и ватным тампоном.

Приступают к исследованию образцов крови. Автоматической или обычной пипеткой наносят на нижнюю призму 0,1 мл (2 кап­ли) сыворотки крови и плотно закрывают камеру. Зеркалом на­правляют свет в окно камеры и поворачивают винт до тех пор, по­ка граница светотени не достигнет пересечения двух визирных ли­ний. Через окуляр по шкале отсчета показателя преломления дважды отсчитывают показатель преломления. Вычисляют среднее показание. Марлевой салфеткой удаляют с поверхности призм сы­воротку, протирают поочередно ватными тампонами, сухим и смо­ченным спиртово-эфирной смесью до чистого сухого состояния. В случае использования стеклянной палочки ее после каждого об­разца сыворотки крови промывают и высушивают марлей. Иссле­дуют следующую пробу.

Р асчет. Содержание белка (г/л) определяют по таблице 10 с учетом величины показателя преломления рефрактометра. Если температура в камере во время исследования не соответствует 20 °С, то вводят поправку 0,0001 на каждый градус: в случае низкой тем­пературы поправку вычитают, при более высокой — прибавляют.

П римечание. Рефрактометрический метод дает ошибку в случаях использования сыворотки со следами гемолиза, содержащего много липидов, билирубина, а также сахара и мочевины. Недостаточное промывание линз между анализами приводит к контаминации последних и завышению результатов. Определение общего белка в сыворотке крови по биуретовой реак­ции. Принцип. Белки реагируют в щелочной среде с меди суль­фатом, образуя соединения, окрашенные в фиолетовый цвет.

Реактивы: 0,9%-ный раствор натрия хлорида (ч. д. а., х. ч.); 0,2 моль/л раствор натрия гидроксида (ч. д. а., х. ч.), свободного от углекислого газа (кипяченая дистиллированная вода);

0,5%-ный раствор калия йодида (ч. д. а., х. ч.) в 0,2 моль/л рас­творе натрия гидроксида. 0,5 г йодида калия помещают в мерную колбу на 100 мл, доводят 0,2 моль/л раствором натрия гидроксида до метки. Реактив стабилен в течение 2 нед при хранении в посуде из темного стекла;

калий-натрий виннокислый 4-водный (сегнетова соль) (ч. д. а.);

меди сульфат 5-водный (ч. д. а., х. ч.);

биуретовый реактив основной. 4,5 г калия-натрия виннокисло­го 4-водного (KNaC6H₄06 • 4Н₂0) растворяют в мерной колбе на 100 мл в 40 мл 0,2 моль/л раствора натрия гидроксида. После рас­творения прибавляют 1,5 г меди сульфата (CuS0₄) и 0,5 г калия йо­дида (KI). Перемешивают до полного растворения и доводят до 100 мл 0,2 моль/л раствором натрия гидроксида. Хранят в посуде из темного стекла. Реактив стоек;

рабочий раствор биуретового реактива. Смешивают одну часть основного биуретового раствора с четырьмя частями 0,5%-ного раствора калия йодида. Хранят в холодильнике в темной посуде не более 2 нед;

калибровочный раствор альбумина основной. В пробирку вно­сят 1 г кристаллического сывороточного (из человеческой или бы­чьей сыворотки) альбумина и 9 мл 0,9%-ного раствора натрия хло­рида. Тщательно перемешивают. 1 мл раствора содержит 0,1 г белка. Хранят в холодильнике. Сывороточный альбумин должен отвечать требованиям стандарта.

Оборудование: фотоэлектроколориметр; колбы мерные.

Ход определения. К0,1мл сыворотки крови прибав­ляют 5 мл рабочего раствора биуретового реактива, смешивают, избегая образования пены. Через 30 мин (но не позже чем через 1 ч) измеряют оптическую плотность на ФЭКе в кювете с толщи­ной слоя 1 см при длине волны 540—560 нм (зеленый светофильтр) против контроля (5 мл рабочего раствора биуретового реактива и 0,1 мл 0,9 %-ного раствора натрия хлорида).

Р асчет ведут по калибровочному графику. При построении калибровочного графика готовят рабочие калибровочные растворы из основного стандартного раствора 10%-ного белка (табл. 11).

Из каждого из четырех разведений альбумина и одной неразве­данной пробы берут по 0,1 мл и прибавляют по 5 мл рабочего би­уретового реактива. Через 30 мин измеряют экстинкцию на ФЭКе, как в опыте против холостой пробы.

Измерения оптической плотности стандартных растворов начи­нают с растворов наименьшей концентрации. По полученным дан­ным из пяти определений строят калибровочную кривую, которую периодически проверяют.

Примечания: 1. При содержании белка в сыворотке крови боль­ше 10 % сыворотку разводят физиологическим раствором 1:1, результат умножают на 2. 2. Реф­рактометрический и биуретовый методы по точ­ности сравнимы между собой. Биуретовый метод хорошо воспроизводимый, однако необходимо использовать реактивы ч. д. а. или х. ч. Строго соблюдать правила их приготовления и хранения, предъявлять строгие требования к наборам реак­тивов заводского изготовления, использовать ки­пяченую дистиллированную воду. Источники: 43, 67.

Клиническое значение. Белки крови выполняют многие функции: поддерживают постоянство онкотического давления, рН крови, уровень катионов крови, играют важную роль в образовании иммунитета, комплексов с углеводами, липидами, гормонами и дру­гими веществами.

Альбумины и фибриноген крови образуются в печеночных клетках, глобулины — в клетках ретикуло-эндотелиальной систе­мы костного мозга и ретикулоэндотелиальных (купферовых или звездчатых) клетках печени. Поэтому содержание сывороточных белков во многом зависит от состояния печени. При болезнях пе­чени снижается синтез альбуминов и фибриногена, увеличивается образование глобулинов (за исключением цирроза), наступает дис-протеинемия, нарушаются процессы обновления белков.

Нормативы содержания общего белка сыворотки крови приве­дены в приложениях 5—7.

Снижение количества общего белка в сыворотке крови (гипопро-теинемия) отмечается при длительном недокорме животных, али­ментарной остеодистрофии, уровской болезни, гипокобальтозе, эндемическом зобе, хронических расстройствах желудочно-ки­шечного тракта, нефрите, нефрозе, циррозе печени, туберкулезе и других заболеваниях, при которых снижаются аппетит и усвоение питательных веществ корма.

Повышение уровня общего белка в сыворотке крови (гиперпротеи-немия) в условиях интенсивного животноводства встречается зна­чительно чаще, чем гипопротеинемия. Оно бывает при белковом перекорме, кетозе, вторичной остеодистрофии, токсикозах и дру­гих болезнях, сопровождающихся дистрофией или воспалением печени. Повышение содержания общего белка в сыворотке крови в этих случаях идет за счет глобулиновых фракций при одновре­менном уменьшении концентрации альбуминов.

Гиперпротеинемия бывает при тяжелых формах диареи, дегид­ратации организма, острых воспалительных процессах, флегмоне, сепсисе, пневмонии, бронхопневмонии и др.

Примечание. Концентрация общего белка в плазме крови на 3—5 г/л больше, чем в сыворотке, вследствие при­сутствия в ней фибриногена. После кормления со­держание белка повышается.

Определение белковых фракций в сыворотке крови. Для определения белковых фракций в сыворотке крови ис­пользуют методы фотометрии, высаливания нейтральными солями, электрофоретического фракционирования, иммунологические и др.

Из электрофоретических методов предпочтение отдается элект­рофорезу на пленках из ацетата целлюлозы и электрофорезу на бу­маге. Однако для выполнения этих методов требуются дефицитные реактивы и специальные приспособления и приборы, поэтому ши­рокого применения в ветеринарии они не находят. Наиболее про­стые методы приведены ниже.

Определение альбумина в сыворотке крови по реакции с бром-крезоловым зеленым. Принцип. При взаимодействии альбу­мина с бромкрезоловым зеленым в слабокислой среде в присутс­твии детергента образуется окрашенный комплекс синего цвета.

Реактивы: уксусная кислота, 1 моль/л. В мерную колбу вместимостью 1 л вносят 60 мл ледяной уксусной кислоты и дово­дят объем до метки;

натрия гидроксид (ч. д. а., х. ч.), 1 моль/л;

полиоксиэтиленлауриловый эфир (бридж 35);

ацетатный буфер, 0,05 моль/л, рН 4,2 с добавлением детергента. 0,85 г бриджа 35 растворяют в 200 мл воды, добавляют 50 мл 1 моль/л раствора уксусной кислоты, 13,2 мл 1 моль/л раствора на­трия гидроксида и доводят объем водой до 1 л. Перемешивают, проверяют рН. Реактив стабилен при хранении в холодильнике;

бромкреозоловый зеленый (БКЗ) водорастворимый индикатор (ч. д. а.). 1,2 ммоль/л. 0,4292 БКЗ растворяют в 200 мл воды в мер­ной колбе вместимостью 500 мл и доводят объем до метки. Стаби­лен при хранении в холодильнике в посуде из темного стекла;

рабочий раствор БКЗ в ацетатном буфере. В мерную колбу вместимостью 1 л вносят 85 мл 1,2 ммоль/л раствора БКЗ, доводят объем до метки ацетатным буфером с детергентом. Стабилен при хранении в холодильнике в посуде из темного стекла;

основной калибровочный раствор альбумина, 10 г на 100 мл. Можно использовать ампулированный 10%-ный раствор альбуми­на плацентарного.

Оборудование: фотоэлектроколориметр (ФЭК) или спек­трофотометр.

Ход определения. 10 мкл сыворотки крови (или 0,1 мл сыворотки, разведенной в 10 раз 0,9%-ным раствором NaCl) тща­тельно перемешивают, избегая образования пены, с 4 мл рабочего раствора БКЗ в ацетатном буфере. Через 5—10 мин измеряют на ФЭКе в кювете с толщиной слоя 1 см при длине волны 630—690 нм (красный светофильтр) против холостой пробы на реактивы или на спектрофотометре при длине волны 625 нм в кювете с толщиной слоя 1 см. Окраска стабильна в течение 8 ч.

Холостую пробу ставят так же, как опытную, но вместо сыво­ротки добавляют 0,1 мл воды.

Расчет ведут по калибровочной кривой. Построение калиб­ровочной кривой: готовят ряд разведений основного калибровоч­ного раствора, как указано в таблице 12. Калибровочные растворы обрабатывают так же, как и опытные, но вместо сыворотки добав­ляют 10 мкл калибровочного раствора. Калибровочная кривая ли­нейна до концентрации альбумина 60 г/л.