19. Разведения для построения калибровочного графика

Основной раствор ./V-ацетилнейрамино-вой кислоты, мл	Вода, мл	Содержание в 1 мл		Концентрация в плазме
		мкг	ммоль	мг/л	ммоль/л
0,1	0,9	50	162	200	0,65
0,2	0,8	100	324	400	1,29
0,3	0,7	150	485	600	1,94
0,4	0,6	200	647	800	2,59
0,5	0,5	250	809	1000	3,24

Из каждого рабочего калибровочного раствора с указанной концентрацией берут по 1 мл, добавляют по 1 мл резорцинового реактива и далее обрабатывают так же, как опытные пробы. Расчет ведут по калибровочному графику.

Клиническое значение. Сиаловые кислоты являются N-ацетильными производными нейраминовой кислоты, играющей важную роль в качестве строительных блоков структурных полиса­харидов. Нейраминовая кислота представляет собой производное девятиуглеродной сахарной кислоты. Ее можно рассматривать как продукт присоединения шестиуглеродного аминосахара к трехуг-леродной сахарной кислоте. Нейраминовая кислота и ее производ­ные — сиаловые кислоты в свободном состоянии присутствуют в крови, ликворе, слюне и других биологических субстратах.

Содержание нейраминовых кислот в сыворотке крови резко возрастает при многих инфекционных заболеваниях, раковых опу­холях, лейкозах, дистрофических и воспалительных процессах в почках (нефроз, нефрит) и печени (гепатоз), а также при пораже­нии соединительной ткани (коллагенозы) и сердечной мышцы.

Источник: 43.

Определение кетоновых тел в крови йодометрическим методом.

Принцип. Из безбелкового фильтрата перегоняют свободный ацетон и ацетон, образовавшийся из ацетоуксусной и р-оксимасля-ной кислот, прибавлением хромовой смеси и кипячением. В дис­тилляте определяют весь перегнанный ацетон, связывая его при­бавлением йода и щелочи. Ацетон с йодом в щелочной среде об-

разует йодоформ и натрия йодид. Избыток йода освобождают прибавлением серной кислоты и определяют при помощи титро­вания раствором натрия тиосульфата. По разности между контро­лем и опытом определяют связанный йод.

Реактивы: 0,3 моль/л раствор натрия гидроксида;

5%-ный раствор цинка сульфата (ZnSC>4 • 7Н2О);

бихроматная смесь: 20 г двухромовокислого калия, 200 мл кон­центрированной серной кислоты, дистиллированная вода до 1 л. В мерную колбу на 1 л вливают 400—600 мл дистиллированной во­ды, осторожно приливают 200 мл серной кислоты и, постоянно помешивая, 20 г мелкоистолченного калия двухромовокислого. После растворения вещества и остывания реактива доливают во­дой до метки;

20%-ный раствор серной кислоты (по объему);

10%-ный раствор натрия гидроксида;

001 н. (0,005 моль/л) раствор йода. Готовят перед анализом из 0,1 н. раствора, приготовленного из фиксанала. Титр 0,01 н. рас­твора йода каждый раз проверяют по 0,01 н. (0,01 моль/л) раствору натрия тиосульфата (натрия серноватистокислого 5-водного, Na₂S0₃-5H₂0);

0,01 моль/л раствор натрия тиосульфата. Готовят из стандарт-тит­ра последовательно, вначале 0,1 моль/л, а затем 0,01 моль/л;

1%-ный раствор крахмала. Готовят заранее насыщенный рас­твор натрия хлорида, наливают его в мерную колбу вместимостью 100 мл больше чем до половины, 1 г растворимого крахмала рас­творяют в пробирке в нескольких миллилитрах дистиллированной воды при нагревании, выливают в ту же колбу и доливают раство­ром натрия хлорида до метки. Раствор стоек, с йодом должен да­вать чисто-синее окрашивание.

Оборудование: приборы (перегонный аппарат, рис. 3) для определения кетоновых тел (20—30 шт.), монтируют в вытяж­ном шкафу; электроплитки (8—10 шт.); микробюретки на 2 и 5 мл; стаканчики химические на 75—100 мл.

Ход определения. Приготовление безбелкового фильтра­та по Сомоджи. К 5 мл крови добавляют 25 мл дистиллированной воды, 10 мл 0,3 моль/л раствора натрия гидроксида, перемешива­ют, добавляют 10 мл 5%-ного раствора цинка сульфата, все тща­тельно взбалтывают и через 10 мин фильтруют через бумажный фильтр. Таким образом получим разведение крови 1:10.

Определение общего количества кетоновых тел. Непосредствен­но перед работой включают холодильник и аппарат просасывают 20 мин текучим паром, налив в перегонную колбу дистиллирован­ную воду и добавив в нее немного пемзы для равномерного кипения.

В приемный стаканчик вносят 20 мл дистиллированной воды, 2 мл 0,01 н. (0,005 моль/л) раствора йода, 2 мл 10%-ного раствора натрия гидроксида и ставят под холодильник перегонного аппара­та так, чтобы конец его погрузился в жидкость. В перегонную кол-

Рис. 3. Перегонный аппарат для определения кетоновых тел

бу вносят 10 мл фильтрата крови, 15 мл бихроматной смеси и 10 мл дистиллированной воды.

Параллельно готовят контроль в двух аппаратах: в перегонную колбу вносят 20 мл дистиллированной воды и 15 мл бихроматной смеси. Приборы закрывают, соединяют холодильники с водопро­водом, пускают воду и включают электроплитки. Опытные образ­цы кипятят 25 мин, контрольные — 15 мин. Затем отключают на­грев, снимают перегонную колбу, холодильник смывают неболь­шим количеством дистиллированной воды. Приемный стаканчик закрывают крышкой и ставят в темное место на 15—20 мин. По ис­течении указанного времени в приемный стаканчик быстро прили­вают 2 мл 20%-ного раствора серной кислоты, добавляют 2—3 кап­ли 1%-ного раствора крахмала и титруют 0,01 моль/л раствором натрия тиосульфата до обесцвечивания.

Расчет ведут по формуле

х = (Л - В) • 0,25 • 100,

где х — количество кетоновых тел, мг%; А — количество 0,01 моль/л раствора натрия тиосульфата, пошедшего на титрование свободного йода в контрольной пробе, мл; В — количество 0,01 моль/л раствора натрия тиосульфата, пошедшего на титрование свободного йода в опытной пробе, мл; 1 мл 0,01 моль/л раствора йода связывает в данных условиях 0,25 мг ацетона; 100 — коэффициент перевода в мг%.

Определение ацетона и ацетоуксусной кислоты. В приемный ста­канчик вносят 20 мл дистиллированной воды, 2 мл 0,01 моль/л раствора йода, 2 мл 10%-ного раствора натрия гидроксида и ставят

под холодильник перегонного аппарата. В перегонную колбу вно­сят 10 мл фильтрата крови, 1 мл 20%-ного раствора серной кисло­ты и 15 мл дистиллированной воды. Параллельно готовят два кон­троля: в перегонную колбу вносят 25 мл дистиллированной воды и 1 мл 20%-ного раствора серной кислоты. Закрывают систему, включают электроплитки и кипятят опытные образцы 25 мин, контроль 15 мин.

Последующий ход анализа такой же, как при определении об­щего количества кетоновых тел.

Расчет ведут по формуле

х = (А - В) • 10,24,

где х — количество ацетона и ацетоуксусной кислоты, мл; А — количество 0,01 моль/л раствора тиосульфата натрия, пошедшего на связывание свободного йода в контроле, мл; В — количество 0,01 моль/л раствора тиосульфата натрия, пошедшего на связывание свободного йода в опыте, мл; 10,24 — коэффициент для перевода в мг%.

1 мл 0,01 н. раствора йода соответствует 0,1024 мг ацетона. Ко­личество фильтрата в опыте соответствует 1 мл крови, поэтому связанное количество йода, умноженное на 10,24 (0,1024 • 100), бу­дет соответствовать содержанию ацетона и ацетоуксусной кислоты в 100 мл крови.

Определение fi-оксимасляной кислоты. В приемный стаканчик вносят те же реактивы, что и для определения общего количества кетоновых тел, ставят его под холодильник. Перегонную колбу после отгонки ацетона и ацетоуксусной кислоты охлаждают и вно­сят в нее 15 мл бихроматной смеси (не сразу, а в два приема). За­крывают систему, подключают электроплитки. Кипение продол­жается 20 мин. Необходимо следить, чтобы кипячение в колбе не прекращалось и жидкость не выкипала (не было потемнения бихромата). Если бихромат из воронки весь вылит, а жидкость вы­кипает, можно частями долить дистиллированную воду. По исте­чении 28 мин отсоединяют от холодильника приемную колбу, от­ключают нагрев. Перегонную колбу и холодильник промывают 4—5 мл дистиллированной воды. Приемный стаканчик ставят в темное место на 15 мин.

Контроль. В перегонную колбу вносят 10 мл дистиллированной воды, 15 мл бихромата. Кипятят 25 мин. Титруют 0,01 моль/л рас­твором натрия тиосульфата, как описано выше.

Расчет ведут по формуле

х = (А- В)-25,

где х — количество р-оксимасляной кислоты, мл; А — количество 0,01 моль/л раствора натрия тиосульфата, пошедшего на связывание свободного йода в контроле; В — количество 0,01 моль/л раствора натрия тиосульфата, пошедшего на связывание свободного йода в опыте; 25 — коэффициент для перевода в мг%.

Примечания. 1. В лаборатории, где проводят определение кето­новых тел, должен быть чистый, свежий воздух. В этих условиях количество 0,01 моль/л раствора натрия тиосульфата, пошедшего на титрование контрольных проб, должно быть только на 0,1 — 0,15 мл меньше, чем было затрачено его при уста­новлении титра 0,01 н. раствора йода, т. е. на 2 мл должно пойти не менее 1,85—1,90 мл. Проверяют чистоту воздуха следующим образом. Рядом с пе­регонным аппаратом ставят приемный стаканчик, в который внесено 5 мл дистиллированной воды, 2 мл 10%-ного раствора натрия гидроксида и 2 мл 0,01 н. раствора йода. Смеси дают постоять 20—30 мин, после чего приливают 2 мл 20%-ного раствора серной кислоты, 2—3 капли 1%-ного раствора крахмала и титруют 0,01 моль/л раство­ром натрия тиосульфата. Если в лаборатории воз­дух чистый, то на титрование пойдет около 1,85—1,90 мл раствора натрия тиосульфата, при его загрязнении — значительно меньше. 2. Опре­деление кетоновых тел в молозиве (молоке) про­водят по описанному выше методу. Предваритель­но готовят безбелковый фильтрат. Молозиво (мо­локо) обезжиривают центрифугированием при 3000 мин^-1 в течение 30 мин. Пробу с молозивом (молоком) ставят в морозильную камеру холо­дильника на 20 мин, после чего осторожно отби­рают 5 мл обезжиренной жидкости и определяют в ней кетоновые тела так же, как в крови. Экспресс-метод обнаружения ацетоновых тел в сыворотке (плаз­ме) крови. При содержании в сыворотке крови ацетона, ацетоук­сусной кислоты в концентрации выше 10 мг/100 мл, что бывает при кетозе, их можно обнаружить с использованием специальных тест-пластин или реактива Лестраде, Ланге и др.

Состав реактива Лестраде: натрия нитропруссидного [Na₂(Fe(NO)(CN)₅ • 2Н₂0] 1 часть, аммония сульфата [(NH₄)₂S0₄] 20 частей, натрия карбоната безводного [Иа₂СОз] 20 частей. Компо­ненты мелко измельчают в фарфоровой ступке в однородный поро­шок, который помещают в склянку из темного стекла с пробкой. Хранят 1—2 мес.

Ход определения. На фильтровальную бумагу на кон­чике скальпеля наносят около 50 мг реактива Лестраде и смачива­ют его 2—3 каплями сыворотки (плазмы) крови. Через 40—60 с чи­тают реакцию. Появление сиреневой окраски свидетельствует о наличии в сыворотке крови более 10 мг/100 мл ацетона и ацето­уксусной кислоты (такова степень чувствительности реактива). Чем интенсивнее окраска, тем больше ацетоновых тел в исследуе­мой жидкости. Высокая концентрация ацетоновых тел в крови, молоке и моче присуща кетозу.

Клиническое значение. Кетоновые (ацетоновые) тела — группа органических соединений (Р-оксимасляная кислота, ацетоуксусная кислота и ацетон) — промежуточные продукты об­мена жиров, углеводов и белков. Повышение уровня кетоновых тел в крови, моче, молоке и других биологических субстратах сви­детельствует о нарушении углеводного, жирового и других видов обмена.

У здоровых животных содержание кетоновых тел в крови 1—8 мг/100 мл (0,17—1,3 ммоль/л), в молоке 6—8 мг/100 мл (1,03—1,36 ммоль/л), в моче 6—10 мг/100 мл (1,0—1,7 ммоль/л). Содержание ацетоуксусной кислоты и ацетона в крови составляет около 15 %, а р-оксимасляной кислоты — 85 % общего количества кетоновых тел. (Пределы колебаний содержания кетоновых тел в крови здоровых животных см. в приложении 5.)

Характерный признак кетоза у коров и овцематок — гиперкето-немия, гиперкетонурия, гиперкетонолактия.

При кетозе, особенно в начальной острой стадии заболевания, содержание кетоновых тел в крови, молоке и моче резко повыша­ется, главным образом за счет ацетоуксусной кислоты и ацетона. При затяжном течении болезни, потере аппетита и исхудании уро­вень кетоновых тел в крови падает и нередко не выходит за верх­ние пределы нормы, в то время как в начальный период болезни превышал ее в несколько раз (И. П. Кондрахин).

Умеренная вторичная кетонемия может быть при задержании последа, эндометрите, травматическом ретикулоперитоните, хи­рургической инфекции и других септических процессах.

Вторичная кетонемия (кетонурия) носит нестойкий характер и исчезает с устранением основного первичного заболевания. Кето-немию при кетозе устанавливают у многих животных в стаде, вто­ричная кетонемия встречается у единичных животных.

Источники: 52, 64.

3.3.6. МЕТОДЫ ОЦЕНКИ СОСТОЯНИЯ ЛИПИДНОГО ОБМЕНА

Для оценки состояния липидного обмена в организме живот­ных проводят ряд последовательных и взаимосвязанных операций, включающих следующие этапы: выделение липидов из исследуе­мых субстратов (сыворотки или плазмы крови, молока, яиц, орга­нов, тканей и т. п.); количественное определение отдельных клас­сов липидов без разделения их на классы или после разделения ме­тодом тонкослойной хроматографии (ТСХ); разделение фосфоли­пидов на подклассы; определение жирнокислотного состава общих липидов или отдельных классов (фосфолипидов, моно-, ди- и три-ацилглицеринов, неэтерифицированных жирных кислот (НЭЖК), эфиров холестерина и подклассов фосфолипидов (фосфатидилхо-лина, фосфатидилэтаноламина и др.) и другие показатели.