20. Приготовление рабочих растворов для построения калибровочного графика

N° пробирки

Стандартный раствор триолеииа, мл

Хлороформ, мл

Концентрация общих липидов, мг%

1 2 3 4 5 6

0,17 0,33 0,50 0,67 0,83 1,00

0,83 0,67 0,50 0,33 0,17

200 400 600 800 1000 1200

Берут по 0,01 мл каждого разведения калибровочного раствора и выполняют все операции, как с опытными пробами (обязательно выдерживают в водяной бане точно так же, как и пробирки с ис­следуемой сывороткой). В противном случае цветная реакция с сульфофосфованилиновым реактивом не наступает или будет очень слабой, нехарактерной. Холостую пробу с дистиллирован­ной водой можно не выдерживать в водяной бане.

На основании полученных данных строят калибровочный график.

Прямолинейная зависимость между концентрацией общих ли­пидов и оптической плотностью сохраняется до 1200 мг%. Поэто­му при большей концентрации сыворотку крови разводят физрас­твором и результаты умножают на разведение.

Для определения этим методом содержания общих липидов в тканях животных необходимо свежую или замороженную ткань подвергнуть деемолизу в 33%-ном растворе калия гидроксида* В пробирку помещают 200 или 300 мг ткани, прибавляют 3 мл 33%-ного калия гидроксида и выдерживают на кипящей водяной бане 60—120 мин, периодически встряхивая. Содержимое проби­рок доводят дистиллированной водой до 5 мл и тщательно переме­шивают. Из этого содержимого берут 0,2 мл в другую пробирку, приливают 1 мл серной кислоты и кипятят в бане или выдержива­ют в термостате при температуре 130 "С в течение 20 мин. После охлаждения приливают 2 мл сульфофосфованилиновой смеси и дальнейшие операции проводят так же, как описано выше с сыво­роткой крови. Однако в этом случае при исследовании на ФЭКе удобнее пользоваться кюветами с толщиной слоя 0,5 см. Сравне­ние определения концентрации общих липидов в известных стан­дартных растворах и в пробах, проводимое различными методами, показало высокую точность и воспроизводимость результатов. Источник: 6, 29, 57.

3.3.6.2. Количественное определение классов липидов химическими методами

Для количественного определения отдельных классов липидов используют готовый экстракт липидов, выделенный по методу Фолча, или берут пробы натуральных биосубстратов и поступают, как описано ниже.

Определение содержания фосфолипидов (по Бартлетту—Ушеру). Принцип. Метод основан на минерализации липидов с помо­щью хлорной кислоты. Неорганический фосфор, взаимодействуя с аммония молибдатом, образует фосфомолибденовую кислоту, ко­торую восстанавливают эйконогеном и натрия пиросульфитом в молибденовую синь. По степени окраски, определяемой колори­метрически, вычисляют количество неорганического фосфора, со­держащегося в фосфолипидах. Фосфолипиды стабильны в сыво­ротке или в плазме крови в течение 1 дня при комнатной темпера­туре, 1 нед при хранении в холодильнике.

Реактивы: экстракционная смесь Фолча (хлороформ-ме­танол, 2 : 1);

72 %-ная хлорная кислота (НСЮ4) или смесь равных объемов 60%-ной хлорной и 95—97%-ной серной кислот (плотность 1,84);

5%-ный раствор аммония молибдата [NH₄)g • М07О24 • Н₂0];

сульфит-сульфоновый реактив. 13 г пиросульфита натрия (Na₂S₂05), 0,5 г сульфита натрия (Na₂SOi) и 0,25 г эйконогена (1-амино-2-нафтол-4-сульфоновая кислота) растворяют в 100 мл дистиллированной воды (перегнанной в стеклянном дистиллято­ре) при постоянном встряхивании в течение 1 ч. Фильтруют через бумажный фильтр (лучше через синтетический № 4) и хранят в темной склянке. Реактив готовят еженедельно.

Оборудование: ФЭК или спектрофотометр; песчаная ба­ня; водяная баня; колбочки плоскодонные на 50 и 100 мл; ворон­ки; пробирки с притертыми пробками и делениями на 10 мл; пи­петки.

Ход определения. Для анализа берут 0,5 мл сыворотки крови, 0,5 г гомогената тканей или 0,2—0,4 г желтка и экстрагиру­ют по методу Фолча. В две параллельные пробирки вносят экс­тракт липидов в объеме, соответствующем 0,1 мл сыворотки крови, 0,02 г тканей или 0,01 г яичного желтка, добавляют по 0,6 мл хлор­ной кислоты и ставят на песчаную баню для сжигания при 180 °С.

После просветления содержимого (через 1—1,5 ч) пробирки ох­лаждают и, тщательно перемешивая, последовательно добавляют следующие реактивы: по 4 мл дистиллированной воды, по 0,2 мл сульфит-сульфонового реактива и по 0,2 мл раствора аммония мо-либдата. Затем пробирки закрывают и помещают в водяную баню при 100 "С на 10 мин. После охлаждения колориметрируют при длине волны 660 или 830 нм в кюветах с толщиной слоя 0,5—1 см против контрольной пробы (без липидов).

Расчет ведут по калибровочному графику, для построения которого используют двузамещенный фосфорнокислый калий (К2НРО4), высушенный до постоянной массы. 2,194 г реактива растворяют в 500 мл бидистиллированной воды. 1 мл раствора со­держит 1 мг фосфора. Из основного раствора готовят рабочий рас­твор путем 50-кратного разведения водой (в 1 мл содержится 20 мкг фосфора). Если определение оптической плотности прово­дят на ФЭКе, то калибровочный график строят в пределах от 0,2 до 20 мкг, если же на спектрофотометре, то от 5 до 60 мкг фос­фора (табл. 21).