Глава 9

ИММУНОФЕРМЕНТНЫЕ МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГОРМОНОВ

9.1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТРИЙОДТИРОНИНА (Т₃)

В СЫВОРОТКЕ ИЛИ ПЛАЗМЕ КРОВИ (DIAGNOSTIC

SYSTEM LABORATORY, США)

Принцип. Метод основан на ферментном иммуноанализе, в основе которого лежит конкуренция немеченных и меченных фер­ментом антигенов за определенное число антигенсвязывающих участков антител. Количество фермент-меченых антигенов, связав­шихся с антителами, обратно пропорционально концентрации не­меченых антигенов исследуемого образца. Показатель абсорбции обратно пропорционален количеству трийодтиронина в пробе.

Реактивы: 96 полистириновых микротитрационных ячеек (плашка), внутренние стенки которых покрыты сывороткой с ан­тителами овцы к Тз;

стандарты трийодтиронина — 6 флаконов по 1,0 мл в каждом, обозначенные A—F, содержащие концентрации Т3 соответственно

0 нг/дл, 50, 100, 250, 500 и 750 нг/дл в бычьей альбумин-стабили-зированной основе;

Тз-контроли — 2 флакона по 0,5 мл. Уровни I и II, содержащие высокую и низкую концентрации Т3 в бычьей альбумин-стабили-зированной основе с нертутным консервантом;

Тз-энзимный конъюгатный концентрат — 1 флакон (1,0 мл), содержащий конъюгат трийодтиронинпероксидазы хрена в бычьей альбумин-стабилизирующей основе; содержит консервант;

буфер для приготовления конъюгата Тз-энзим (красный) —

1 флакон (И мл) содержит буфер с консервантом и связанные с протеином ингибиторы;

ТМБ-хромогенный раствор — 1 флакон (11 мл) содержит тетра-метилбензидин (ТМБ) в цитратном буфере с пероксидом водорода;

концентрат моющего раствора — 1 флакон (105 мл) содержит поверхностно-активные вещества в фосфатно-солевом буферном растворе и консервант;

стоп-раствор — 1 флакон (11 мл) содержит 0,2 М раствор сер­ной кислоты.

Примечание. Образцы крови помещают в воду со льдом и не­медленно доставляют в лабораторию, где быстро отделяют сыворотку или плазму эритроцитов. Все реагенты и пробы перед исследованием следует привести к комнатной температуре (25 °С) и тща­тельно перемешать. Сыворотку (плазму) крови хра­нить не более 48 ч в холодильнике при 2—8 °С. Для более длительного хранения исследуемые образцы замораживают и хранят при —20 "С и ниже. Не ре­комендуется исследовать гемолизированные и ли-пемичные образцы. Образцы сыворотки (плазмы) крови, стандарты и контроли рекомендуется ис­следовать в дублях. Оборудование: микропланшетный иммуноферментный анализатор Stat Fax-2100, настраиваемый на длину волны 450 нм; инкубатор-шейкер (встряхиватель) Stat Fax-2200, настраиваемый на 500—700 движений в 1 мин; автоматическое промывающее уст­ройство Stat Fax-2600; полуавтоматические дозаторы объемом 5—50, 50—200 и 200—1000 мкл, наконечники; градуированная ла­бораторная посуда, полистириновые пробирки; фильтровальная бумага для просушивания стрипов; бидистиллированная вода; миллиметровая бумага для построения калибровочного графика (при отсутствии программного обеспечения).

Подготовка реагентов к анализу. 1. Рабочий раствор Т₃-энзим­ного конъюгатного концентрата: в чистой посуде развести Тз-эн-зимный конъюгатный концентрат (1,0 мл) буфером для приготов­ления конъюгата (1:11). Например, для 16 ячеек необходимо 160 мкл (0,16 мл) конъюгата растворить в 1,6 мл буфера (раствор готовят с небольшим запасом и используют в течение 24 час).

2. Моющий раствор: 100 мл концентрата моющего раствора в колбе растворить в 900 мл бидистиллированной воды.

3. Микротитрационные ячейки: отобрать для исследования не­обходимое количество стрипов с ячейками. Остальные стрипы по­местить в защитный влагонепроницаемый пакет с десикантом.

Ход определения. В используемые ячейки микротитраци-онных стрипов пипеткой вносят по 50 мкл стандартов, контролей, исследуемой сыворотки крови. В каждую ячейку добавляют по 100 мкл свежеприготовленного рабочего раствора Тз-энзимного ко­нъюгатного концентрата. Плашку осторожно встряхивают в течение 20—30 с, затем накрывают ее фольгой и инкубируют 60 мин при комнатной температуре (~25 °С). Промывают ячейки 3 раза, добав­ляя по 300 мкл моющего раствора. В каждую ячейку вносят по 100 мкл ТМБ-хромогенного раствора. Ставят плашку в темное место и инкубируют в течение 15 мин при комнатной температуре («25 °С). Добавляют по 50 мкл стоп-раствора в каждую ячейку и осторожно перемешивают 15—20 с.

Измеряют оптическую плотность растворов каждой ячейки с помощью иммуноферментного плашечного анализатора при длине волны 450 нм. Результаты учитывают в течение 30 мин после до­бавления стоп-раствора. При возможности для более точного из­мерения абсорбции необходимо установить прибор на измерение двойного излучения при длине волны 450 нм с последующей пере­настройкой на 600 или 620 нм.

Полученные значения стандартов Т3 используют для построе­ния стандартной кривой, по которой определяют концентрацию трийодтиронина в исследуемых образцах. Стандартная кривая долж­на быть включена в каждое исследование.

При работе микропланшетного иммуноферментного анализато­ра с персональным компьютером и наличии соответствующего программного обеспечения стандартная кривая и результаты ис­следования проб сыворотки (плазмы) крови высчитываются авто­матически.

9.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕТИРОКСИНА (Т₄) В СЫВОРОТКЕ КРОВИ (DIAGNOSTIC SYSTEM LABORATORY, США)

Принцип. Метод основан на ферментном иммуноанализе, в основе которого лежит конкуренция немеченных и меченных фер­ментом антигенов за определенное количество антигенсвязываю-щих участков антител. Количество фермент-меченых антигенов, связавшихся с антителами, обратно пропорционально концентра­ции немеченых антигенов исследуемого образца. Показатель абсор­бции обратно пропорционален количеству тироксина в пробе.

Реактивы: 96 микротитрационных ячеек (12 стрипов), внут­ренние стенки которых покрыты козьими антителами к мышиным у-глобулинам;

Т4-стандарты — 1 флакон (1,0 мл), маркированный А, содержит 0 мкг/дл тироксина и 5 флаконов (по 0,5 мл), маркированные В—F, содержат концентрации соответственно 0,5, 1,5, 5,0, 15,0 и 50,0 мкг/дл Т₄ в человеческой сыворотке с нертутным консервантом;

Т₄-контроли — 2 флакона по 0,5 мл каждый. Уровни I и II со­держат высокую и низкую концентрации Т₄ в человеческой сыво­ротке с нертутным консервантом;

Т₄-энзимный конъюгатный концентрат — 1 флакон из темного стекла (0,3 мл) содержит Т₄, конъюгированный с пероксидазой хрена в буфере с нертутным консервантом. Растворяют реагент не­посредственно перед использованием;

антитела к Т₄ — 1 флакон (11 мл) содержит мышиные монокло-нальные антитела к Т₄ в буфере с нертутным консервантом;

буфер для приготовления конъюгата Т₄-фермент — 1 флакон (11 мл) содержит белковый буфер с нертутным консервантом;

ТМБ-хромогенный раствор — 1 флакон из темного стекла (И мл), содержащий тетраметилбензидин (ТМБ) в цитратном бу­фере с водорода оксидом;

концентрат моющего раствора — 1 флакон (105 мл) содержит поверхностно-активные вещества в фосфатно-солевом буферном растворе и консервант. Перед использованием развести в 10 частях дистиллированной воды;

стоп-раствор — 1 флакон (11 мл) содержит 0,2 М раствор сер­ной кислоты;

бидистиллированная вода.

Примечание. Все реагенты и пробы перед исследованием следу­ет привести к комнатной температуре (25 °С) и, осторожно вращая, тщательно перемешать. Пони­женная температура реагентов и проб дает зани­женные результаты оптической плотности. Сыво­ротку крови можно хранить при 2—8 °С до 7 дней или более длительное время при минус 20 °С. Сле­дует избегать повторного замораживания и раз­мораживания образцов. Не следует использовать образцы с выраженными признаками гемолиза и липемии.

Оборудование: микропланшетный иммуноферментный анализатор Stat Fax-2100, настраиваемый на длину волны 450, 600 или 620 нм; инкубатор-шейкер (встряхиватель) Stat Fax-2200, на­страиваемый на 500—600 движений в 1 мин; автоматическое про­мывающее устройство Stat Fax-2600; полуавтоматические дозаторы объемом 5—50, 50—200 и 200—1000 мкл, наконечники; градуиро­ванная лабораторная посуда, полистириновые пробирки; фильтро­вальная бумага для просушивания стрипов; миллиметровая бумага для построения калибровочного графика (при отсутствии програм­много обеспечения).

Подготовка реагентов к анализу. 1. Рабочий раствор Т4-ЭНЗИМ-ного конъюгатного концентрата: в чистой посуде развести Т4-ЭН-зимный конъюгатный концентрат (1,0 мл) буфером для приготов­ления конъюгата (1 : 50). Например, для 96 ячеек необходимо рас­творить 220 мкл концентрата конъюгата в 11 мл буфера для приготовления конъюгата Т4-ЭНЗИМ (раствор готовят непосредс­твенно перед применением; неиспользованный раствор конъюгата выливают).

2. Моющий раствор: 100 мл концентрата моющего раствора в колбе растворить в 900 мл бидистиллированной воды.

3. Микротитрационные ячейки: отобрать для исследования не­обходимое количество стрипов с ячейками. Остальные стрипы по­местить в защитный влагонепроницаемый пакет с десикантом.

Ход определения. Перед использованием все реагенты и пробы должны быть приведены к комнатной температуре (-25 °С) и тщательно перемешаны. Образцы сыворотки крови, стандарты и контроли рекомендуется исследовать в дублях.

В используемые ячейки микропланшета дозатором вносят по 25 мкл стандартов, контролей и сыворотки крови. Добавляют в каждую ячейку по 100 мкл свежеприготовленного ^-энзимного конъюгатного раствора (1). Осторожно встряхивают штатив с ячейками 5—10 с, перемешивая содержимое ячеек. Дозатором (лучше многоканальным) вносят в каждую ячейку по 100 мкл бу­ферного раствора с антителами к тироксину. Микротитрационную плашку со стрипами помещают в инкубатор-шейкер для инкуба­ции (t ~ 25 °С) в течение 60 мин, одновременно встряхивая со ско­ростью 500—600 движений в 1 мин. Используя автоматическое мо­ющее устройство, пятикратно аспирируют и тщательно промывают каждую ячейку моющим раствором (по 350 мкл). Удаляют остатки жидкости с ячеек, переворачивая плашку на фильтровальную бу­магу. В каждую ячейку дозатором добавляют по 100 мкл ТМБ-хро-могенного раствора. Закрывают микропланшет и инкубируют ячейки в шейкере (встряхивание с частотой 500—600 движе­ний/мин) при t ~ 25 °С на протяжении 10 мин. В каждую ячейку дозатором добавляют по 100 мкл стоп-раствора (0,2 М раствор сер­ной кислоты) для остановки реакции.

Проводят измерение оптической плотности раствора в ячейках при длине волны 450 нм (в течение 30 мин после добавления стоп-раствора).

Полученные значения стандартов Т4 используют для построе­ния стандартной кривой, по которой определяют концентрацию тироксина в исследуемых образцах.

Примечание. Для перевода мкг/дл в нмоль/л необходимо мкг/дл • 12,9 = нмоль/л.

Клиническое значение. Тиреоидные гормоны (Т3 и Т4) синтезируются в фолликулярных клетках щитовидной железы пу­тем присоединения йода к остаткам молекул аминокислоты тиро­зина, входящих в состав белка — тиреоглобулина (ТГ), который представляет собой крупный растворимый гликопротеин с молеку­лярной массой 660 кД. Ежедневная секреция щитовидной железой Т4 составляет 80—100 мкг, а Т3 — около 5 мкг.

При необходимости под влиянием протеазы и пептидазы лизо-сом фолликулярных клеток ТГ расщепляется, Т3 и Т4 секретиру-ются в кровь, где они связываются с белками плазмы. Т4 обладает высоким сродством к глобулину (тиронинсвязывающий глобулин — ТСГ), меньшим — к преальбумину и в небольших количествах свя­зывается с альбумином (соответственно 75 % с ТСГ и 15—20 % — с пре- и альбумином). Лишь 0,05 % Т4 остается в свободном (несвя­занном) состоянии. Т3 связывается практически только с ТСГ, а относительное количество его свободной фракции составляет 0,5 %. Т4 дольше сохраняется в крови — биологический период по­лужизни его составляет 7—9 дней, а Т3 — 2 дня. Связанные и сво­бодные формы гормонов находятся в динамическом равновесии. Свободные йодтиронины относительно легко проникают сквозь мембрану клеток, влияя на все виды обмена веществ.

Около 85 % циркулирующего в крови Т4 дейодируется в печени и почках с образованием почти 80 % суточного количества Т3.

Содержание общего Т4 у коров колеблется в пределах 50—100 нмоль/л (В. В. Сахнюк, 2003), Т₃ — 1,5—2,5, у телят старше 10-дневного возраста соответственно 50—150 и 2,0—3,5 нмоль/л. При клинически выраженном гипертиреозе содержание Т3 и Т4 повыше­но, а при гипотиреозе — снижено (у коров содержание Т3 состав­ляет 0,23—1,9 нмоль/л, Т₄ — 14,0—52 нмоль/л (В. П. Фасоля, 1996; В. Л. Романюк, 2000). В большинстве случаев уровень Т3 коррели­рует с содержанием Т4. У телят с врожденным зобом выявлена ги­перфункция щитовидной железы. Прежде всего увеличивается со­держание Т₃ (В. Л. Романюк, 2002).

Функция щитовидной железы изменяется при некоторых бо­лезнях внутренних органов: уменьшение содержания ее гормонов установлено при бронхопневмонии телят, остеодистрофии, кетозе и гепатодистрофии коров, т. е. развивается так называемый фено­мен «нормальной больной щитовидной железы».

В настоящее время наблюдается тенденция к определению сво­бодного Т4 у людей как одного из основных маркеров функцио­нального состояния щитовидной железы. В ветеринарии этот тест не нашел еще своего места.

9.3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТИРЕОТРОПИНА (ТТГ) В СЫВОРОТКЕ КРОВИ (DYAGNOSTIC SYSTEM LABORATORY, США)

Принцип. Определение тиреотропина основано на энзимсвя-занном одношаговом сендвичеподобном иммуноанализе. Стандар­ты, контроли и исследуемые образцы сыворотки крови инкубиру­ют в микротитрационных ячейках, покрытых антит-чТТГ-антите-лами с другими антит-чТТГ-антителами, меченными энзимами пероксидазы хрена (ПХ). После промывания ячейки инкубируют с субстратом тетраметилбензидина (ТМБ), добавляют кислотный стоп-раствор и определяют степень энзимного оборота субстрата путем измерения абсорбции при двойном излучении на длине вол­ны 450 и 620 нм. Показатели абсорбции исследуемых образцов прямо пропорциональны концентрации ТТГ в пробе.

Реактивы: 96 полистириновых микротитрационных ячеек, пок­рытых анти-чТТГ-антителами;

ТТГ-стандарты — 1 флакон (А, 1 мл) содержит 0 мкМЕ/мл, 5 флаконов по 0,5 мл (В—F) с концентрациями 0,15, 0,70, 2,00, 7,50 и 22,00 мкМЕ/мл ТТГ в сыворотке свиньи с нертутным консерван­том;

ТТГ-контроли — 2 флакона по 0,5 мл каждый. Уровни I и II со­держат высокую и низкую концентрации ТТГ в сыворотке свиньи с нертутным консервантом;

аналитический буфер В — 1 флакон (11 мл) содержит протеи­новый буфер с нертутным консервантом;

ТЛТ-антител-энзимный конъюгатный концентрат — 1 флакон из темного стекла (0,3 мл) содержит анти-чТТГ-антитела, конъ-югированные с энзимами пероксидазы хрена в протеиновом буфе­ре с нертутным консервантом (перед использованием необходимое количество концентрата в зависимости от количества исследуемых образцов растворяют в конъюгатном растворителе;

ТМБ-хромогенный раствор — 1 флакон (11 мл) содержит тетра-метилбензидин в цитратном буфере с пероксидом водорода;

моющий концентрат — 1 флакон (100 мл) содержит буферный со­левой раствор с неионным детергентом. Перед использованием раз­водят в 10 частях деионизированной или бидистиллированной воды;

стоп-раствор — 1 флакон (11 мл) содержит 0,2 М раствор сер­ной кислоты;

бидистиллированная вода.

Примечание. Все реагенты и пробы перед исследованием следу­ет привести к комнатной температуре (25 °С) и, осторожно вращая, тщательно перемешать. Сыво­ротку крови хранят не более 24 ч в холодильнике при 2—8 °С. Для более длительного хранения ис­следуемые образцы замораживают и хранят при минус 20 "С и ниже. Не рекомендуется исследо­вать гемолизированные и липемичные образцы. Пробирку с кровью после взятия пробы тотчас по­мещают в воду со льдом и немедленно доставляют в лабораторию или отделяют сыворотку или плаз­му, или замораживают и в замороженном виде до­ставляют в лабораторию. Антикоагулянт — гепа­рин, а не ЭДТА. Оборудование: микропланшетный иммуноферментный анализатор Stat Fax-2100, настраиваемый на длину волны 450 нм и пе­ренастраиваемый на 600 и 620 нм; инкубатор-шейкер (встряхиватель) Stat Fax-2200, настраиваемый на 500—700 движений/мин; автомати­ческое промывающее устройство Stat Fax-2600; полуавтоматические пипетки на 50 и 100 мкл, наконечники; градуированная лабораторная посуда, полистириновые пробирки; фильтровальная бумага для про­сушивания стрипов; миллиметровая бумага для построения калибро­вочного графика (при отсутствии программного обеспечения).

Подготовка реагентов к анализу. 1. Антител-энзимный конъ-югатный раствор: антител-энзимный конъюгатный концентрат развести в аналитическом буфере (1 : 50), исходя из числа исполь­зуемых ячеек (при использовании плашки на 96 ячеек 220 мкл ко-нъюгатного концентрата разводят в 11 мл аналитического буфера). Разводят его непосредственно перед исследованием.

2. Моющий раствор: 100 мл моющего концентрата растворить в 900 мл бидистиллированной воды. Раствор стабилен при комнат­ной температуре в посуде из темного стекла в течение 1 мес.

3. Микротитрационные ячейки: отобрать для исследования не­обходимое количество стрипов, а остальные стрипы поместить в защитный влагонепроницаемый пакет с десикантом.

Ход определения. Перед использованием все реагенты и пробы должны быть приведены к комнатной температуре (~ 25 °С).

Образцы сыворотки крови, стандарты и контроли необходимо ис­следовать в параллельных пробах.

В используемые ячейки микротитрационных стрипов пипеткой вносят по 50 мкл стандартов, контролей и исследуемой сыворотки крови. В каждую ячейку добавляют по 100 мкл свежеприготовлен­ного антител-энзимного конъюгатного раствора. Микротитраци-онную плашку со стрипами помещают в инкубатор-шейкер для инкубации (t ~ 25 °С) в течение 90 мин, одновременно встряхивая со скоростью 500—600 движений в 1 мин. Используя автоматичес­кое моющее устройство, пятикратно аспирируют и тщательно про­мывают каждую ячейку моющим раствором по 350 мкл, используя программу № 3 вошера. После этого удаляют остатки жидкости с ячеек, переворачивая плашку на фильтровальную бумагу. Полуав­томатической пипеткой (лучше использовать 8-канальную) в каж­дую ячейку добавляют по 100 мкл ТМБ-хромогенного раствора и инкубируют ячейки при комнатной температуре (~ 25 °С) в тече­ние 10 мин, одновременно встряхивая в инкубаторе-шейкере со скоростью 500—600 движений в 1 мин.

По окончании инкубации в каждую ячейку пипеткой добавля­ют по 100 мкл стоп-раствора (0,2 М раствор серной кислоты) для прерывания реакции и развития окрашивания. Помещают плашку со стрипами в иммуноферментный анализатор (ридер) для измере­ния абсорбции раствора в ячейках при длине волны 450 нм (в те­чение 30 мин после добавления стоп-раствора). Перед учетом аб­сорбции микротитрационных ячеек необходимо установить при­бор на «0» в соответствии с нулевым стандартом (Blanc). При возможности для более точного измерения абсорбции необходимо установить прибор на измерение двойного излучения при длине волны 450 нм с последующей перенастройкой на 600 или 620 нм.

Полученные значения стандартов ТТГ используют для постро­ения стандартной кривой, по которой определяют концентрацию тиреотропина в исследуемых образцах.

Примечание. Все стандартные растворы приведены в мкМЕ/мл.

Для перевода в мМЕ/л необходимо мкМЕ/мл х х 1,0 = мМЕ/л.

Клиническое значение. ТТГ секретируется аденогипо-физом. Он стимулирует поглощение щитовидной железой йодида из крови, усиливает синтез тиреоглобулина и его распад с высво­бождением Тз и Т4 в кровь. Секреция тиреоидных гормонов после выделения ТТГ возрастает уже через несколько минут. Уровень ТТГ в крови менее 5 мМЕ/л (1—4 нг/мл, или 0,6—3,8 мкг/л) на протяжении суток не меняется, и поэтому даже разовое определе­ние его дает полезную клиническую информацию. Продукция ги-пофизарного ТТГ, в свою очередь, находится под контролем гипо-таламических гормонов — стимулирующего тиреотропин-рилизинг гормона (ТРГ) и ингибирующего соматостатина.

ТТГ является маркером при оценке функционального состоя­ния щитовидной железы. В основе регуляции секреции ТТГ лежит механизм обратной связи: высокие концентрации Т3 и Т4 ингиби-руют, а низкие стимулируют секрецию ТТГ.

При гипертиреозе синтез и секреция ТТГ в гипофизе по принци­пу обратной связи блокированы высокими уровнями Т3 и Т₄: коли­чество ТТГ в крови менее 0,2 мИЕ/мл или гормон в крови не оп­ределяются. Введение Т3 быстро снижает концентрацию ТТГ. Ана­логичное действие оказывает и Т₄, но для этого требуется доза в 10 раз больше, чем Т3, а торможение длится в 10 раз дольше.

9.4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ К0РТИ30ЛА В СЫВОРОТКЕ (ПЛАЗМЕ) КРОВИ (DIAGNOSTIC SYSTEM LABORATORY, США)

Принцип. Метод основан на конкуренции между немеченым антигеном и энзим-меченым антигеном на определенное количес­тво связей с антителом. Количество энзим-меченых антигенов, свя­занных с антителами, обратно пропорционально концентрации не­меченого исследуемого.

Реактивы: 96 микротитрационных ячеек (12 стрипов), внут­ренние стенки которых покрыты козьей антикроличьей глобулино-вой сывороткой;

кортизол-антисыворотка (голубая) — 1 флакон (11 мл) содер­жит кроличью антикортизоловую сыворотку в протеиновом (BSA) буфере с нертутным консервантом;

кортизол-стандарты — 1 флакон (0,5 мл), обозначенный А, со­держит 0 мкг/дл кортизола; 7 флаконов (по 0,5 мл каждый), обоз­наченные В—Н, содержат кортизол в протеиновом буфере (BSA) с нертутным консервантом в концентрациях 0,5, 1,5, 4,0, 10,0, 20,0, 40,0 и 60 мкг/дл;

кортизол-контроли — 2 флакона (по 0,5 мл каждый) с уровнями I и II содержат кортизол низкой и высокой концентрации в про­теиновом буфере сыворотки с нертутным консервантом;

кортизол-энзимный конъюгатный концентрат — 1 ампула (0,3 мл) содержит раствор кортизола в протеиновом буфере с не­ртутным консервантом. Перед исследованием разводят конъюгат-ным растворителем;

конъюгатный растворитель — 1 флакон (11 мл) содержит осно­ванный на протеине буфер с нертутным консервантом;

ТМБ-хромогенный раствор — 1 флакон (11 мл) содержит рас­твор тетраметилбензидина (ТМБ) в цитратном буфере с водорода пероксидом;

моющий концентрат — 1 флакон (100 мл) содержит буферные соли с неионным детергентом. Перед использованием разводят в 10 объемах деионизированной или бидистиллированной воды;

стоп-раствор — 1 флакон (11 мл) содержит 0,2 М раствор сер­ной кислоты;

бидистиллированная вода.

Примечание. Все реагенты и пробы перед началом анализа должны быть приведены к комнатной температуре (25 °С) и тщательно перемешаны. Пониженная температура реагентов и проб дает заниженные ре­зультаты оптической плотности. Сыворотку (плаз­му) крови, свободную от гемолиза, можно хранить при 2—8 "С 24 ч или более длительное время при минус 20 "С.

Оборудование: микропланшетный иммуноферментный анализатор Stat Fax-2100, настраиваемый на длину волны 450 нм и 600 или 620 нм; инкубатор-шейкер (встряхиватель) Stat Fax-2200, настраиваемый на 500—700 движений в 1 мин; автоматическое промывающее устройство Stat Fax-2600; полуавтоматические доза­торы на 5—50, 50—200 и 200—1000 мкл, наконечники; градуиро­ванная лабораторная посуда; фильтровальная бумага для просуши­вания стрипов; миллиметровая бумага для построения калибро­вочного графика (при отсутствии программного обеспечения).

Подготовка реагентов к анализу. 1. Энзимный конъюгатный раствор: кортизол-энзимный конъюгатный концентрат развести в чистой посуде конъюгатным растворителем в соотношении 1:50 соответственно количеству используемых ячеек. Если использует­ся вся плашка, необходимо отмерить точно 200 мкл кортизол-эн-зимного конъюгатного концентрата и 10 мл конъюгатного раство­рителя. Готовят непосредственно перед использованием.

2. Моющий раствор: 100 мл концентрата моющего раствора в колбе растворить в 900 мл бидистиллированной воды.

3. Микротитрационные ячейки: отобрать для исследования не­обходимое количество стрипов с ячейками. Остальные стрипы по­местить в защитный влагонепроницаемый пакет с десикантом.

Ход определения. В используемые ячейки микропланшета дозатором вносят по 25 мкл стандартов, контролей и сыворотки крови. Добавляют по 100 мкл свежеприготовленного энзимного ко­нъюгатного раствора. Осторожно встряхивают штатив с ячейками 5—10 с, перемешивая содержимое ячеек. Дозатором (лучше много­канальным) вносят в каждую ячейку по 100 мкл кортизол-антисы-воротки. Микротитрационную плашку со стрипами помещают в инкубатор-шейкер для инкубации (~ 25 °С) в течение 45 мин, од­новременно встряхивая со скоростью 500—700 встряхиваний в 1 мин. Используя автоматическое моющее устройство, аспириру-ют и пятикратно тщательно промывают каждую ячейку моющим раствором по 350 мкл, избегая попадания пузырьков воздуха. Пос­ле этого удаляют остатки жидкости с ячеек, переворачивая плашку на фильтровальную бумагу. В каждую ячейку дозатором добавляют по 100 мкл ТМБ-хромогенного раствора. Закрывают микроплан­шет и инкубируют ячейки в шейкере (встряхивание с частотой 500—700 движений в 1мин) при t ~ 25 "С 10—15 мин. В каждую ячейку дозатором добавляют по 100 мкл стоп-раствора (0,2 М рас­твор серной кислоты). Встряхивают плашку 5—10 с.

Измеряют оптическую плотность раствора в ячейках при длине волны 450 и 620 нм (в течение 30 мин после добавления стоп-рас­твора).

Перед считыванием абсорбции необходимо установить прибор на «0» соответственно с нулевым стандартом (Blank).

Полученные значения стандартов кортизола используют для построения стандартной кривой, по которой определяют концен­трацию гормона в исследуемых образцах. Пробы, значения кото­рых превышают наивысший стандарт, необходимо дополнительно развести стандартом 0 мкг/дл и повторно исследовать.

Примечание. Все стандарты приведены в мкг/дл. Для перевода в нмоль/л необходимо мкг/дл • 27,6 = нмоль/л.

Клиническое значение. Кортизол вырабатывается корой надпочечников из холестерола. Стимулируется секреция кортизола адренокортикотропным гормоном гипофиза (АКТГ), выделение которого, в свою очередь, активируется гипоталамическим корти-котропным рилизинг-гормоном (КРГ, кортиколиберином). Секре­ция кортиколиберина контролируется соответствующими центра­ми головного мозга. Около 90 % циркулирующего в крови корти­зола находится в связанном с глобулином состоянии, остальное количество — в свободном.

Кортизол усиливает синтез белка, в печени стимулирует синтез глюкозы из неуглеводистых источников, прежде всего — из ами­нокислот (глюконеогенез).

При первичной недостаточности коры надпочечников уменьшает­ся синтез глюко- и минералокортикоидов (кортизола и альдостеро-на), при вторичной, обусловленной снижением секреции АКТГ, — глюкокортикоидов. Гипоадренокортицизм чаще встречается у со­бак, особенно у самок (80 %) молодого или среднего возраста (дат­ский дог, ротвейлер, пудель, терьер).

Гиперфункция коры надпочечников сопровождается увеличением синтеза кортизола и вызывает развитие синдрома Кушинга. Заболе­вание встречается у собак, чаще у самок среднего возраста. Выра­женную генетическую предрасположенность к болезни имеют со­баки пород боксер и пудель. В 80—85 % случаев гиперкортицизм у собак развивается вследствие поражения гипофиза (аденома или гипертрофия).

При первичной недостаточности коры надпочечников уровень кортизола уменьшается, а содержание АКТГ по принципу обрат­ной связи — увеличивается (у собак — больше 50 нмоль/л). Диа­гностика синдрома Кушинга, вызванного аденомой гипофиза, ос­нована на увеличении уровня АКТГ в сыворотке (плазме) крови.

При опухолях коры надпочечников синтез кортизола увеличен, а АКТГ — уменьшен.

В плазме крови бычков черно-пестрой породы 13—14-месяч­ного возраста, по данным В. П. Радченко (1980), содержится 2,1—4,0 мкг/100 мл кортизола (58,0—110 нмоль/л), у коров на 7—8-м месяцах стельности — 9,8—17,4 нг/мл (Черемисинов с соавт., 1990), за 60-45 дней до отела — 2,9—40,3 (14,1 ± 1,66) нмоль/л, в период половой охоты — 13,3—23,2 нмоль/л (Г. Г. Харута, 1999).

9.5. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИНСУЛИНА В СЫВОРОТКЕ (ПЛАЗМЕ) КРОВИ (DIAGNOSTIC SYSTEM LABORATORY, США)

Принцип. В основе определения гормона положен принцип энзимсвязанного одношагового сендвичеподобного иммуноанали-за. Стандартные, контрольные растворы и сыворотку (плазму) кро­ви инкубируют с антителами инсулина в микротитрационных ячей­ках, покрытых другими антиинсулиновыми антителами. После от­мывания ячейки инкубируют с тетраметилбензидином и после добавления стоп-раствора определяют степень энзимного оборота субстрата измерением абсорбции при длине волны 450 и 620 нм.

Реактивы: 96 полистириновых микротитрационных ячеек (плашка), на внутренние стенки которых нанесены антиинсулиновые антитела;

стандарты инсулина (лиофилизированные) — 1 флакон (обоз­наченный А) содержит 0 мкМЕ/мл; 5 флаконов (обозначенных В—F), содержат растворы с концентрациями соответственно 3,0, 10,0, 30,0, 100,0 и 300,0 мкМЕ/мл инсулина в человеческой сыворот­ке с нертутным консервантом. Стандарты А—Е используют при регу­лярных исследованиях (динамический ряд 3—100 мкМЕ/мл), а стан­дарты А, С—F — при исследованиях широкого диапазона (10—300 мкМЕ/мл);

контроли инсулина (лиофилизированные) — 2 флакона. Уров­ни I и II. Содержат высокую и низкую концентрации инсулина в человеческой сыворотке с нертутным консервантом;

инсулиновый антител-энзимный конъюгатный концентрат — 1 флакон содержит 0,3 мл раствора инсулина, конъюгированного с пероксидазой хрена в буфере с нертутным консервантом. Перед использованием растворяют в аналитическом буфере;

аналитический буфер (зеленый) — 1 флакон (28 мл) содержит протеиновый буфер с нертутным консервантом;

ТМБ-хромогенный раствор — 1 флакон (11 мл) содержит тетра-метилбензидин в цитратном буфере с пероксидом водорода;

концентрат моющего раствора — 1 флакон (60 мл) содержит со­левой раствор с неионным детергентом;

стоп-раствор — 1 флакон (11 мл) содержит 0,2 М раствор сер­ной кислоты;

бидистиллированная вода.

Примечание. Все реагенты и пробы перед исследованием следу­ет привести к комнатной температуре (25 °С) и, ос­торожно вращая, тщательно перемешать. Сыворот­ку (плазму) крови хранить не более 24 ч в холо­дильнике при 2—8 °С. Для более длительного хра­нения исследуемые образцы замораживают и хра­нят при минус 20 °С и ниже. Не рекомендуется исследовать гемолизированные и липемичные об­разцы.

Оборудование: микропланшетныйиммуноферментныйана­лизатор Stat Fax-2100, настраиваемый на длину волны 450 нм, 600 или 620 нм; инкубатор-шейкер (встряхиватель) Stat Fax-2200, на­страиваемый на 500—700 движений в 1 мин; автоматическое промы­вающее устройство Stat Fax-2600; полуавтоматические дозаторы объемом 5—50, 50—200 и 200—1000 мкл, наконечники; градуиро­ванная лабораторная посуда, полистириновые пробирки; фильтро­вальная бумага для просушивания стрипов; миллиметровая бумага для построения калибровочного графика (при отсутствии програм­много обеспечения).

Подготовка реагентов к анализу. 1. Антител-энзимный конъ-югатный раствор: в чистой посуде развести инсулиновый анти­тел-энзимный конъюгатный концентрат в аналитическом буфере (1 : 50), исходя из числа используемых ячеек. Если будет исполь­зована вся плашка, необходимо 200 мкл антител-энзимного конъ-югатного концентрата инсулина растворить в 10 мл аналитическо­го буфера. Разводить непосредственно перед использованием.

2. Стандарт А восстановленный (0 мкМЕ/мл): во флакон А до­бавить 1 мл бидистиллированной воды. Хранить до 14 дней в хо­лодильнике при температуре 2—8 "С.

3. Стандарты В—F восстановленные с концентрациями инсули­на 3,0, 10,0, 30,0, 100,0 и 300,0 мкМЕ/мл соответственно: в каждый флакон добавить по 0,5 мл бидистиллированной воды. Хранить до 14 дней при температуре 2—8 "С.

4. Моющий раствор: концентрат моющего раствора растворить в 25 частях бидистиллированной воды.

5. Микротитрационные ячейки: отобрать для исследования не­обходимое количество стрипов с ячейками. Остальные стрипы по­местить в защитный влагонепроницаемый пакет с десикантом.

Ход определения. Для регулярной аналитической проце­дуры в каждую ячейку микротитрационных стрипов пипеткой вно­сят по 25 мкл стандартов А—Е, контролей, исследуемой сыворотки (плазмы) крови (для аналитической процедуры широкого диапазона в ячейки вносят по 10 мкл стандартов, A, C—F, контролей, исследу­емой сыворотки (плазмы) крови). Добавляют по 100 мкл свежепри­готовленного антител-энзимного конъюгатного раствора. Инкуби­руют ячейки при температуре 25 "С в течение 60 мин, встряхивая в шейкере микротитрационных плашек со скоростью 500—700 дви­жений в 1 мин. Аспирируют и промывают ячейки 5 раз (по 350 мкл моющего раствора), после чего осушают плашку, переворачивая на абсорбирующий материал. В каждую ячейку вносят по 100 мкл ТМБ-хромогенного раствора и инкубируют ячейки в течение 10 мин при комнатной температуре (~ 25 °С), встряхивая в шейке­ре при 500—700 движений в 1 мин. Добавляют в каждую ячейку по 100 мкл стоп-раствора (0,2 М раствор серной кислоты). Измеряют оптическую плотность растворов каждой ячейки с помощью имму-ноферментного шишечного анализатора при длине волны 450 и 620 нм. Результаты учитывают в течение 30 мин после добавления стоп-раствора.

Перед считыванием абсорбции необходимо установить прибор на «0» соответственно с нулевым стандартом (Blank).

Полученные значения стандартов инсулина используют для построения стандартной кривой, по которой определяют концен­трацию гормона в исследуемых образцах.

При работе микропланшетного иммуноферментного анализато­ра с персональным компьютером и наличии соответствующего программного обеспечения стандартная кривая и результаты ис­следования проб сыворотки (плазмы) крови высчитываются авто­матически.

Примечания. Концентрация стандартов приведена в мкМЕ/мл.

Для перевода в нг/мл необходимо знать: 25 мкМЕ/мл = 1 нг/мл, т. е. мкМЕ/мл • 0,04 = нг/мл. Сыворотка (предпочтительнее) или плазма крови без следов гемолиза. В качестве антикоагу­лянта используют гепарин. Кровь для получения плазмы центрифугируют (не позднее чем через 15 мин) в центрифуге с охлаждением при 4 °С. От­деляют сыворотку или плазму в пластиковые про­бирки с крышками и замораживают при минус 20 или минус 70 °С. В герметически закрытой пробир­ке инсулин стабилен 1 день при 4—8 °С и 6 мес при минус 20 °С. Уровень инсулина в плазме выше, чем в сыворотке. Клиническое значение. Инсулин секретируется (З-клет-ками островков Лангерганса поджелудочной железы. Инсулин — наиболее важный гормон, регулирующий жировой обмен, и единс­твенный физиологический гормон, обусловливающий снижение уровня глюкозы в крови. Влияние гормона реализуется за мембран­ным типом — комплекс инсулин-рецептор повышает проницае­мость клеточных мембран для глюкозы, обеспечивая этим ее пере­ход из крови в ткани. Инсулин активирует фосфоглюкотрансферазу (гексокиназу) и таким образом обеспечивает превращение глюкозы в глюкозо-6-фосфат с последующим превращением глюкозы в гли­коген. Конечным результатом влияния инсулина на обмен углеводов

является уменьшение концентрации глюкозы в крови (гипогликемия) и накопление гликогена в мышцах, печени и других органах. При де­фиците инсулина клетки теряют способность к использованию глю­козы. Количество ее в крови увеличивается (гипергликемия).

Влияние инсулина на обмен липидов заключается в том, что он обеспечивает использование углеводов для синтеза высших карбо-новых кислот, а из них — липидов. Кроме того, инсулин ингиби-рует тканевую липазу, в том числе и за счет торможения образова­ния цАМФ, и этим сокращает расход липидов. Окисление жиров уменьшается, что приводит к ожирению организма.

При уменьшении секреции инсулина происходит повышенный распад аминокислот, усиливается окисление липидов (липолиз) с на­коплением свободных жирных кислот, кетоновых тел и холестерола.

У здоровых собак уровень глюкозы в крови составляет 80—120 мг/100 мл (4,4—6,56 ммоль/л). Уровень гликемии выше 200 мг/100 мл (11,1 ммоль/л) считают характерным для сахарного диабета. У сухостойных коров содержание инсулина составляет около 20 мкМЕ/мл (К. Остин, Р. Шорт, 1987), за 60—45 дней до отела - 11,7-67,2 (35,2 ± 3,2) нмоль/л (Г. Г. Харута, 1999).

9.6. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПАРАТИРЕОИДНОГО ГОРМОНА (ПТГ) В СЫВОРОТКЕ (ПЛАЗМЕ) КРОВИ (DIAGNOSTIC SYSTEM LABORATORY, США)

Принцип. В основе исследования заложен «сендвич-метод», или метод двойных антител. В ячейки, предварительно покрытые ПТГ-антителами, вносят стандарты, контроли, исследуемые пробы и специфические антитела к ПТГ, меченные биотином. При этом образуется комплекс АТ-ПТГ-АТ + биотин. После первой инкуба­ции и промывания ячеек для выявления этого комплекса добавляют иммуноферментный конъюгат, меченный пероксидазой. После вто­рой инкубации и промывания в ячейки добавляют хромогенный рас­твор (ТМБ), интенсивность окрашивания которого изменяется пря­мо пропорционально концентрации специфических антител в пробе. Измеряют интенсивность окрашивания при длине волны 450 нм.

Реактивы: 96 полистироловых микротитрационных ячеек, покрытых анти-И-ПТГ;

И-ПТГ стандартный растворитель — 1 флакон (1 мл), обозна­ченный А, содержит 0 нг/мл И-ПТГ в буферной основе с нертут­ным консервантом;

И-ПТГ стандарты — 6 флаконов по 0,5 мл (В—G) с концентра­циями 10,0, 30,0, 100,0, 250,0, 750,0 и 2000 пг/мл в буферной осно­ве с нертутным консервантом;

И-ПТГ контроли — 2 флакона по 1 мл с уровнями I и II, содер­жащие низкую и высокою концентрацию И-ПТГ в буферной ос­нове с нертутным консервантом;

И-ПТГ аналитический буфер — 1 флакон (11 мл) содержит фосфатно-буферную основу с нертутным консервантом;

И-ПТГ антител-биотиновый конъюгат — 1 флакон (11 мл) со­держит анти-И-ПТГ антитела, конъюгированные с биотином в протеиновом буфере с нертутным консервантом;

стрептавидин-энзимный конъюгатный концентрат — 1 флакон (0,3 мл) содержит стрептавидин-энзимный конъюгат с нертутным консервантом. Развести за 10—15 мин перед использованием в И-ПТГ аналитическом буфере;

ТМБ-хромогенный раствор — 1 флакон (11 мл) содержит рас­твор тетраметилбензидина (ТМБ) в цитратном буфере с гидроген-пероксидазой;

моющий концентрат — 1 флакон (100 мл) содержит буферные соли с неионизированными детергентами;

стоп-раствор — 1 флакон (11 мл) содержит 0,2 М раствор сер­ной кислоты;

деионизированная или бидистиллированная вода. Примечание. Все реагенты и пробы перед исследованием следу­ет привести к комнатной температуре (25 °С) и тщательно перемешать. Образец крови немедлен­но помещают в воду со льдом. Сыворотку (плазму) крови сепарируют в охлаждаемой центрифуге (4 °С) и хранят при минус 20 °С и ниже. Не реко­мендуется исследовать гемолизированные, икте-ричные и липемичные образцы. Оборудование: микропланшетныйиммуноферментныйана­лизатор, настраиваемый на длину волны 450 нм и перенастраивае­мый на 600 или 620 нм; инкубатор-шейкер (встряхиватель) для мик­ропланшет, настроенный на 500—700 встряхиваний в 1 мин; авто­матическое промывающее устройство; полуавтоматические пипетки объемом 50 и 100 мкл; фильтровальная бумага для просушивания стрипов; миллиметровая бумага для построения калибровочного графика (при отсутствии программного обеспечения).

Подготовка реагентов к анализу. 1. Моющий раствор: десяти­кратно развести моющий концентрат бидистиллированной водой (соотношение 1:9).

2. Стрептавидин-энзимный конъюгатный раствор: стрептави- дин-энзимный конъюгатный концентрат развести в соотношении 1:50 конъюгатный растворителем соответственно количеству ис- пользуемых ячеек. Для полной плашки на 96 проб необходимо 240 мкл концентрата развести в 12 мл конъюгатного растворителя.

Примечание. Антител-стрептавидин-конъюгатный концентрат разводят непосредственно перед исследованием.

3. Микротитрационные ячейки: отобрать для исследования не- обходимое количество стрипов с ячейками. Неиспользуемые стри- пы поместить во влагонепроницаемый пакет с десикантом.

Ход определения. В используемые ячейки вносят по 50 мкл стандартов, контролей и исследуемых проб сыворотки (плазмы) крови (в параллелях). Добавляют в каждую ячейку по 100 мкл антител-биотинового конъюгата. Инкубируют ячейки при комнатной температуре (21—25 °С) в течение 2,5 ч, встряхивая в шейкере микроплат (500—700 встряхиваний в 1 мин). После инку­бации при помощи автоматического промывающего устройства сначала проводят аспирацию (откачку содержимого из каждой ячейки), а затем 5 раз промывают каждую лунку 350 мкл моющего раствора. Остатки жидкости в ячейках удаляют, переворачивая и постукивая плашкой по фильтровальной бумаге. Пипеткой вносят в каждую ячейку по 100 мкл стрептавидин-энзимного конъюгатного раствора. Инкубируют плашку со встряхиванием в инкубаторе-шей-кере при комнатной температуре (22—25 °С, 500—700 встряхиваний в 1 мин) 30 мин. После аспирации 5 раз промывают каждую ячейку 350 мкл моющего раствора и осушают плашку с ячейками, перево­рачивая несколько раз на фильтровальную бумагу. В каждую ячей­ку вносят по 100 мкл ТМБ-хромогенного раствора и инкубируют в шейкере 10—15 мин (22—25 °С, 500—700 встряхиваний в 1 мин), избегая попадания прямых солнечных лучей.

Примечание. Окраска в ячейках может развиваться быстрее или медленнее чем за время, рекомендованное для комнатной температуры, поэтому необходимо ви­зуально наблюдать за развитием окраски для уста­новления оптимального времени инкубации.

После инкубации в каждую ячейку полуавтоматической пипет­кой добавляют по 100 мкл стоп-раствора (0,2 М раствор серной кислоты) для остановки цветной реакции. Измеряют оптическую плотность стандартов, контролей и исследуемых образцов на пла-шечном иммуноферментном анализаторе (ридере) в режиме двой­ного излучения: при X равно 450 нм и 620 нм (не позднее 30 мин после добавления стоп-раствора).

Полученные значения стандартов ПТГ используют для постро­ения стандартной кривой, по которой определяют концентрацию гормона в исследуемых пробах.

Примечание. Все основные характеристики приведены в пг/мл.

Для перевода в SI (нмоль/л) необходимо пг/мл х х 0,11 = нмоль/л.

Клиническое значение. Паратгормон совместно с каль-цитонином и активными метаболитами витамина D регулирует го-меостаз кальция в организме, что осуществляется путем усиления трансмембранного транспорта кальция из кишечника [совместно с 1,25 (ОН^Эз], повышения реабсорбции кальция в дистальных отделах почечных канальцев и усиления резорбции костной ткани. При снижении содержания кальция в сыворотке крови по принци­пу обратной связи увеличивается секреция ПТГ, что, в свою оче­редь, повышает синтез l,25(OH)₂D3, а последний усиливает резор­

бцию костной ткани путем повышения активности остеокластов, всасывание кальция в кишечнике через регуляцию синтеза СаСБ и его реабсорбцию в дистальных канальцах почек (Л. И. Апуховская с соавт., 2003).

В крови клинически здоровых коров перед отелом содержание па-ратгормона составляет 4,36 ± 0,19 нг/мл, при послеродовой гипокаль-циемии — 1,11 ± 0,12 нг/мл (И. Ф. Ганджаев, 1986). У коров с опти­мальным содержанием кальция в сыворотке крови (2,26—2,4 ммоль/л) уровень паратгормона составляет 6,1—59,8 пг/мл (О. Ю. Голуб, 2003).

9.7. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КАЛЬЦИТОНИНА

В СЫВОРОТКЕ КРОВИ (DIAGNOSTIC SYSTEM

LABORATORY, США)

Принцип. В основу определения гормона положен принцип энзимсвязанного двушагового сендвичеподобного иммуноанализа. Стандарты, контроли и исследуемые образцы инкубируют в микро­титрационных ячейках, покрытых антикальцитониновыми антите­лами. После инкубации и отмывания ячейки инкубируют с другими антикальцитониновыми антителами, меченными энзимом перокси­дазы хрена. После вторичной инкубации и промывания ячейки ин­кубируют с субстратом тетраметилбензидина и добавляют стоп-рас-твор. Определяют степень энзимного оборота субстрата измерени­ем абсорбции на микроплашечном ридере при длине волны 450 и 620 нм. Показатели абсорбции прямо пропорциональны концент­рации кальцитонина.

Реактивы: 96 полистириновых микротитрационных ячеек с козьими антикальцитониновыми IgG, иммобилизированными на боковых стенках каждой ячейки;

стандарты кальцитонина (лиофилизированные) — 1 флакон (3,0 мл), обозначенный А, с концентрацией 0 пг/мл; 4 флакона (по 1 мл каждый), обозначенные В—F, с концентрациями 10,0; 50,0; 250,0 и 600 пг/мл кальцитонина в буфере с нертутным кон­сервантом;

контроли кальцитонина (лиофилизированные) — 2 флакона по 1 мл с уровнями I и II, содержащие низкую и высокую концентра­ции кальцитонина в буфере с нертутным консервантом;

кальцитониновый антител-биотиновый конъюгатный концент­рат — 1 флакон содержит 0,4 мл биотинмеченого концентрата кальцитонина в протеиновом буфере с нертутным консервантом. Растворить за 10—15 мин перед использованием в аналитическом буфере;

стрептавидин-энзимный конъюгатный концентрат — 1 темный флакон (0,3 мл) содержит стрептавидин-ХПО концентрат в проте­иновом буфере с нертутным консервантом. За 5—10 мин до иссле­дования растворяют 1 часть реагента в 50 частях аналитического буфера D;

аналитический буфер D — 1 флакон (22 мл) содержит буфер с не­ртутным консервантом;

ТМБ-хромогенный раствор — 1 флакон (11 мл) содержит рас­твор тетраметиленбензидина (ТМБ) в нитратном буфере с перок-сидом водорода;

моющий концентрат I — 1 флакон (100 мл) содержит буферные соли с неионным детергентом. Перед использованием развести в 10 частях бидистиллированной воды;

стоп-раствор — 1 флакон (11 мл) содержит 0,2 М раствор сер­ной кислоты;

деионизированная и бидистиллированная вода. Примечание. Все реагенты и пробы перед исследованием следу­ет привести к комнатной температуре (25 °С) и тщательно перемешать путем аккуратного враще­ния флаконов. Антикоагулянты — гепарин, ЭДТА (1,5 мл/кг), стабилизированные апротинином (тра-сиполот) из расчета 40 КИЕ/мл (калликреининги-бирующих единиц). В таких условиях кальцитонин в крови стабилен в течение 1 ч при комнатной температуре (Gudor М. и соавт., 1996). Предпоч­тительна плазма без гемолиза и липемии. После взятия кровь немедленно помещают в воду со льдом и тотчас доставляют в лабораторию или центрифугируют, немедленно сливают плазму и замораживают при минус 20 °С или минус 70 °С. Избегать повторного замораживания и размора­живания исследуемых проб. Оборудование: микропланшетный иммуноферментный ана­лизатор, настраиваемый на длину волны 450 нм и перенастраивае­мый на 600 или 620 нм; инкубатор-шейкер (встряхиватель) для мик­ропланшет на 500—700 встряхиваний в 1 мин; автоматическое про­мывающее устройство; полуавтоматические пипетки на 50 и 100 мкл; фильтровальная бумага для просушивания стрипов; мил­лиметровая бумага для построения стандартной кривой (при от­сутствии программного обеспечения).

Подготовка реагентов к анализу. 1. Моющий раствор: моющий концентрат развести бидистиллированной водой в соотношении 1:10.

2. Кальцитониновый антител-биотиновый конъюгатный рас­твор: кальцитонин-биотиновый конъюгатный концентрат развести в аналитическом буфере D (1:50). Для полной плашки на 96 проб необходимо отобрать точно 220 мкл кальцитонин-биотинового ко­нъюгатного концентрата и 11 мл аналитического буфера D.

Примечание. Реагент необходимо разводить не более чем за 10—15 мин до начала исследования.

3. Стрептавидин-энзимный конъюгатный раствор: стрептави- дин-энзимный конъюгатный концентрат развести в аналитичес- ком буфере D в соотношении 1:50 соответственно количеству ис- пользуемых ячеек. Для полной плашки на 96 проб необходимо 220 мкл концентрата развести в 11 мл аналитического буфера D.

Примечание. Реагент разводят за 5—10 мин до начала исследо­вания.

4. Микротитрационные ячейки: отобрать необходимое количес- тво ячеек для исследований. Неиспользуемые ячейки поместить в пакет и тщательно его закрыть.

Ход определения. В используемые ячейки вносят по 100 мкл стандартов, контролей и исследуемых проб сыворотки (в параллелях) и добавляют в каждую ячейку по 100 мкл кальцитонинового анти-тел-биотинового конъюгатного раствора. Ячейки инкубируют на про­тяжении 60 мин, встряхивая в шейкере микроплат (500—700 встря­хиваний в 1 мин) при комнатной температуре (22—25 °С). После инкубации ячейки 5 раз промывают при помощи автоматического промывающего устройства, используя по 350 мкл моющего раство­ра. На последнем этапе используют двойную аспирацию (двойная откачка содержимого из одной лунки). При необходимости удаля­ют остатки жидкости, переворачивая плашку со стрипами на фильтровальную бумагу. Полуавтоматической пипеткой в каждую ячейку вносят по 100 мкл стрептавидин-энзимного конъюгатного раствора. Инкубируют в инкубаторе-шейкере при том же режиме (22—25 "С, 500—700 встряхиваний в 1 мин) 30 мин. Аспирируют и пятикратно промывают плашку моющим раствором по 350 мкл. Осу­шают ячейки на фильтровальной бумаге. В каждую ячейку вносят по 100.мкл ТМБ-хромогенного раствора и инкубируют 10—12 мин (22—25 °С, 500—700 встряхиваний в 1 мин), избегая попадания на плашку прямых солнечных лучей. Пипеткой добавляют в каждую ячейку по 100 мкл стоп-раствора (0,2 М раствор серной кислоты) для остановки цветной реакции. Плашку со стрипами помещают в иммуноферментный анализатор (ридер) и в режиме двойного из­лучения (вначале при 450 нм, затем при 620 нм) считывают абсор­бцию растворов в ячейках (не позднее 30 мин после добавления стоп-раствора).

По полученным значениям стандартов строят стандартную кри­вую, по которой определяют концентрацию кальцитонина в иссле­дуемых пробах сыворотки.

Примечание. Все стандарты кальцитонина представлены в пг/мл.

Для перевода в пмоль/л необходимо пг/мл х х 0,29 = пмоль/л.

Клиническое значение. Кальцитонин продуцируют па-рафолликулярные клетки (С-клетки) щитовидной железы и в по­нятие «тиреоидные гормоны» обычно не включается. Он не содер­жит йода и представляет собой полипептид из 32 аминокислотных остатков. Кальцитонин непосредственно влияет на костную ткань и почки, где расположены его рецепторы, соответственно на остео­класты и на клетки тонкого сегмента восходящего колена петли Ген-ле и начала дистальных извитых канальцев. Он снижает уровень кальция в крови, когда тот превышает 2,5 ммоль/л. Тормозя актив­ность остеокластов; кальцитонин угнетает резорбцию костей, что сопровождается гипокальциемией, гипофосфатемией и снижени­ем активности щелочной фосфатазы. В почках кальцитонин уве­личивает экскрецию кальция и фосфора.

Секрецию кальцитонина в физиологических условиях регули­рует, по-видимому, только уровень кальция в сыворотке крови. Сведения о содержании кальцитонина в сыворотке крови живот­ных ограничены. У клинически здоровых коров кальцитонина в сыворотке крови содержится 4,11 ± 0,13 пг/мл, у больных после­родовой гипокальциемией несколько ниже (И. Ф. Гаджаев, 1986).

9.8. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТЕСТОСТЕРОНА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ (DIAGNOSTIC AUTOMATION INC., США)

Принцип. Метод основан на конкурентном связывании тес­тостерона исследуемой сыворотки и конъюгата тестостерона-ПХ с постоянным количеством кроличьего антитестостерона. В ячейки, покрытые антикроличьими IgG, вносят по 10 мкл тестостероновых стандартов, контролей и исследуемых проб сыворотки, добавляют 100 мкл конъюгата тестостерона-ПХ и 50 мкл кроличьего антитес-тостеронового реагента. Инкубируют при 37 °С. Во время инку­бации известное количество меченного ПХ тестостерона конку­рирует с эндогенным тестостероном в стандарте, пробе или кон­трольной сыворотке за определенное число мест связывания на специфических антителах к тестостерону. При этом количество связанного меченного пероксидазой тестостерона обратно пропор­ционально содержанию эндогенного тестостерона в исследуемой сыворотке. Несвязанный конъюгат меченого тестостерона вымы­вают из ячеек. После этого в ячейки добавляют ТМБ-реагент. Раз­витие окраски прекращают добавлением стоп-раствора (кислоты хлористоводородной) и измеряют абсорбцию на ридере при длине волны 450 нм.

Реактивы: 96 микротитрационных ячеек, покрытых козьими антикроличьими IgG;

референс-стандарты тестостерона — 6 флаконов по 0,5 мл с концентрациями 0,0, 0,1, 0,5, 2,0, 6,0 и 18 нг/мл. Готовы к ис­пользованию;

кроличий антитестостероновый реагент (розового цвета) — 1 флакон (7 мл);

конъюгат тестостерона и ПХ (голубого цвета) — 1 флакон (12 мл);

тестостероновые контроли — 2 флакона по 0,5 мл с уровнями I и II. Готовы к использованию;

ТМБ-реагент — 1 флакон (11 мл);

стоп-раствор (кислота хлористоводородная) — 1 флакон (11 мл); деионизированная или бидистиллированная вода. Примечания. Материалом для исследования служит сыворотка или плазма без гемолиза и липидемии. Антикоагу­лянт — гепарин. Образец крови помещают в воду со льдом и тотчас центрифугируют, отделяют сы­воротку или плазму, охлаждают в холодильнике или замораживают при минус 20 °С. Сыворотку или плазму хранят 1 день при комнатной темпера­туре, 3 дня при 4—8 °С и 1 год при минус 20 "С. Оборудование: микроплашечный иммуноферментный ана­лизатор (ридер); инкубатор-шейкер для микропланшет; автомати­ческое промывающее устройство; полуавтоматические пипетки на 10, 50, 100 мкл и 1,0 мл; фильтровальная бумага или бумажные сал­фетки для просушивания стрипов; миллиметровая бумага.

Подготовка реагентов к анализу. Перед использованием все ре­агенты и пробы необходимо привести к комнатной температуре (18—25 °С). Сыворотки, в которых уровень тестостерона свыше 18 нг/мл, следует развести разбавителем сыворотки.

Ход определения. Закрепляют в штативе необходимое ко­личество ячеек. Вносят по 10 мкл стандартов, контролей и иссле­дуемых проб (в параллелях) в соответствующие ячейки. Добавляют в каждую ячейку по 100 мкл конъюгата тестостерона ПХ и по 50 мкл кроличьего антитестостеронового реагента. Тщательно и аккуратно перемешивают в течение 30 с. Инкубируют в инкубато-ре-шейкере при 37 "С на протяжении 90 мин. При помощи авто­матического промывающего устройства исследуемые ячейки 5 раз промывают бидистиллированной водой. Остатки жидкости в ячей­ках удаляют, переворачивая и постукивая плашкой по фильтро­вальной бумаге. Вносят в каждую ячейку по 100 мкл ТМБ-хромо-генного раствора, осторожно перемешивают в течение 5 с. Инку­бируют при комнатной температуре (18—25 °С) 20 мин. Добавляют в каждую ячейку по 100 мкл стоп-раствора. Осторожно перемеши­вают 30 с. Очень важно, чтобы голубая окраска полностью пере­шла в желтую. Считывают абсорбцию на ридере при длине волны 450 нм в течение 15 мин.

По полученным результатам стандартов строят калибровочную кривую и по ней определяют концентрацию гормона в исследуе­мых пробах сыворотки. При подсчете результаты предварительно разведенных образцов умножают на фактор разведения.

Клиническое значение. Тестостерон — это наиболее ак­тивный мужской половой гормон, который вырабатывается глав­ным образом интерстициальными клетками семенников; у самок — в надпочечниках, фолликулах, желтом теле, однако в 10—15 раз меньшем количестве. Секрецию тестостерона стимулируют го надо -тропные гормоны: фолликулотропин и лютеотропин. У самцов тестостерон специфически действует на развитие и функцию орга­нов размножения, созревание спермиев и сохранение их жизнеспо­собности, развитие вторичных половых признаков. Кроме того, по­вышает основной обмен, усиливает синтез белков (оказывает ана­болическое действие).

Повышение уровня тестостерона наблюдают при патологии ги-поталамогипофизарной системы, опухолях семенников и яични­ков, гиперплазии надпочечников.

При недостаточной секреции тестостерона, фолликулотропина (ФСГ), лютеотропина (ЛГ) развивается гипогонадизм. Различают первичный и вторичный гипогонадизм. Причинами первичного являются врожденные аномалии, которые сопровождаются недо­статочным развитием семенников и мошонки, двусторонний крипторхизм или орхит, инфекционный эпидидимит баранов. Вторичный гипогонадизм вызывает недостаточная секреция гона-дотропных гормонов — ФСГ и ЛГ.

В сыворотке крови коров в период половой охоты содержание тестостерона составляет в среднем 116,8 + 9,0 пг/мл (В. С. Шипи-лов с соавт., 1987), на 7-м месяце стельности 241,4 ± 40,7 пг/мл (К. Г. Дашукаева, 1992), за месяц до отела 6,0—7,0 нмоль/л и через 15—30 дней после отела — 3,2—3,5 нмоль/л (В. И. Еременко, 2000).

9.9. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОГЕСТЕРОНА В СЫВОРОТКЕ ИЛИ ПЛАЗМЕ КРОВИ (DIAGNOSTIC AUTOMATION INC., США)

Принцип. Метод основан на конкурентном связывании про­гестерона исследуемой сыворотки и конъюгата прогестерона-ПХ (меченного пероксидазой хрена) с постоянным количеством кро­личьего антипрогестерона. В ячейки, покрытые антикроличьими IgG, добавляют стандарты, контроли и исследуемые пробы сыво­ротки, конъюгат прогестерона-ПХ и кроличий антипрогестероно-вый реагент. Во время инкубации при комнатной температуре (18—25 °С) известное количество меченного пероксидазой хрена прогестерона конъюгирует с эндогенным прогестероном в стан­дарте, пробе и контроле за определенное число мест связывания на специфических антителах к прогестерону. При этом количес­тво связанного меченного пероксидазой прогестерона обратно пропорционально содержанию эндогенного прогестерона в ис­следуемой сыворотке.

Несвязанный конъюгат меченого прогестерона отмывают из ячеек, добавляют хромогенный раствор и после развития окраски добавляют стоп-раствор для остановки цветной реакции. Считыва­ние результатов проводят на ридере при длине волны 450 нм.

Реактивы: 96 микротитрационных ячеек, покрытых козьим антикроличьим IgG;

референс-стандарты прогестерона — 6 флаконов по 0,5 мл с концентрациями 0,0, 0,5, 3,0, 10,0, 25,0 и 50,0 нг/мл. Готовы к ис­пользованию;

кроличий антипрогестероновый реагент (розового цвета) — 1 флакон (7 мл);

конъюгат прогестерона и ПХ (голубого цвета) — 1 флакон (12 мл); прогестероновые контроли — 2 флакона по 0,5 мл с уровнями I и П. Готовы к использованию; ТМБ-реагент — 1 флакон (11 мл); стоп-раствор — 1 флакон (11 мл); деионизированная или бидистиллированная вода. Примечание. Все реагенты и пробы перед исследованием следу­ет привести к комнатной температуре (25 °С) и тщательно перемешать. Сыворотка или плазма крови, свободная от гемолиза. Антикоагулянт — ЭДТА. Кровь из вены берут в пластиковую про­бирку, которую помещают в воду со льдом, цент­рифугируют, сливают во вторичную пробирку, ох­лаждают (4 °С) или замораживают. Прогестерон стабилен в сыворотке и плазме в герметично за­крытой пробирке в течение 1 дня при 4—8 °С, при минус 20 °С — длительное время. Оборудование: микроплашечный иммуноферментный ана­лизатор (ридер); инкубатор-шейкер для микропланшет; автомати­ческое промывающее устройство; полуавтоматические пипетки на 25, 50, 100, 200 мкл и 1,0 мл; фильтровальная бумага или бумажные салфетки для просушивания стрипов; миллиметровая бумага.

Подготовка реагентов к анализу. Перед использованием все ре­агенты и пробы необходимо привести к комнатной температуре (18—25 °С). Сыворотки, в которых ожидается концентрация про­гестерона свыше 50 нг/мл, следует предварительно развести разба­вителем сыворотки.

Ход определения. Закрепляют в штативе необходимое ко­личество ячеек. Вносят по 25 мкл стандартов, контролен и иссле­дуемых проб (в параллелях) в соответствующие ячейки. Добавляют в каждую ячейку по 100 мкл конъюгата прогестерона-ПХ и по 50 мкл кроличьего антипрогестеронового реагента. Тщательно и аккуратно перемешивают в течение 30 с. Инкубируют при комнат­ной температуре (18—25 °С) на протяжении 90 мин. При помощи автоматического промывающего устройства исследуемые ячейки пятикратно промывают бидистиллированной водой. Остатки жид­кости в ячейках удаляют, переворачивая и постукивая плашкой по фильтровальной бумаге. Вносят по 100 мкл ТМБ-хромогенного раствора в каждую ячейку, осторожно перемешивают в течение 5 с. Инкубируют при комнатной температуре (18—25 °С) 20 мин. До­бавляют в каждую ячейку по 100 мкл стоп-раствора. Осторожно перемешивают 30 с. Очень важно, чтобы голубая окраска полно­стью перешла в желтую. Считывают абсорбцию на ридере при дли­не волны 450 нм в течение 15 мин.

По полученным результатам стандартов строят калибровочную кривую и по ней определяют концентрацию гормона в исследуе­мых пробах сыворотки. При подсчете результаты предварительно разведенных образцов умножают на фактор разведения.

Клиническое значение. Прогестерон — женский поло­вой гормон, который синтезируется желтым телом, частично над­почечниками и плацентой, у самцов — семенниками. Прогестерон обладает широким спектром воздействия на внутренние органы, но основное его влияние направлено на репродуктивные органы: тормозит сократительную функцию гладких мышц гениталий, со­действует закрытию канала шейки матки и образованию в нем слизистой пробки при беременности, обеспечивает секрецию эн­дометрия, маточных желез, иммунную толерантность к эмбриону и детской части плаценты. Этот гормон является исключительно важным в регуляции функции надпочечников, яичников и плацен­ты во время беременности. Определение прогестерона используют для установления овуляции и изучения лютеиновой фазы, диа­гностики беременности на самых ранних стадиях.

Количество прогестерона зависит от физиологического состоя­ния животных. В сыворотке крови коров в период стадии полового возбуждения его содержание колеблется в пределах 0,74—1,20 нг/мл, половой охоты — 0,36—0,56 нг/мл. В период стельности физиологи­ческий уровень гормона составляет 2,2—5,5 нг/мл, в том числе на 7-м месяце — 3,20—3,88, на 8-м — 2,82—3,36 нг/мл (А. Г. Нежда­нов с соавт., 1989). За 2—3 нед до отела содержание прогестерона резко уменьшается и во время отела определяется минимальное его количество. По уровню его в сыворотке крови на 21—24-й дни после осеменения можно определять стельность коровы (В. Д. Не-двига, Г. Г. Харута, 2002), за 60—45 дней до отела — прогнозиро­вать течение родов и послеродового периода (Г. Г. Харута, 1999).

В начале половой охоты кобыл содержание прогестерона в плаз­ме крови составляет в среднем 1,23 ± 0,45 нг/мл, через 12 ч после овуляции — 0,75 ± 0,43, через 2 дня после окончания стадии поло­вого возбуждения — 1,82 + 0,74, на 6—8-й дни полового цикла — 3,79 ± 0,95, на 11-14-й дни - 4,23 ± 1,4, а на 15—17-й дни — 3,21 ± 1,39 нг/мл.

Наивысшая концентрация прогестерона в плазме крови кобыл бы­вает на 2-м и 3-м месяцах жеребости (7,12 ± 2,10 и 6,81 ± 1,15 нг/мл), на 4—6-м месяцах содержание его уменьшается с 5,24 + 0,82 до 2,80 ± ± 0,40 нг/мл, а на 7—11-м увеличивается с 3,63 ± 0,65 до 5,64 ± ± 0,76 нг/мл (Д. В. Повалюк, 2001).

У сук в течение стадии возбуждения полового цикла (длитель­ность 7—11 дней) уровень прогестерона составляет 0,4 + 0,1 нг/мл, в начале течки — 1,1 ± 0,1, т. е. в этот период прогестагенная ак­тивность яичников находится на низком уровне. В конце эстраль­ного периода желтые тела становятся функционально активными и поэтому содержание прогестерона увеличивается до 5,3 ± 0,3 нг/мл. После окончания периода половой охоты наступает стадия тормо­жения полового цикла (длительность ее 50—60 дней). В начале этой стадии концентрация прогестерона составляет 17,4 ± 0,6 нг/мл, в середине щенности (на 30-й день) — 26,8 ± 0,7 нг/мл, на 55-е сутки щенности — 4,3 + 0,3 нг/мл. После стадии торможения наступает пе­риод полового покоя длительностью 115—130 сут. Уровень прогесте­рона в начале и в конце этого периода стабилен — 0,9 ± 0,1 нг/мл (П. В. Ковалев, 2002).

9.10. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЭСТРАДИОЛА В СЫВОРОТКЕ ИЛИ ПЛАЗМЕ КРОВИ (DIAGNOSTIC AUTOMATION INC., США)

Принцип. Метод основан на конкурентном связывании эст-радиола исследуемой сыворотки и конъюгата эстрадиола-ПХ (пе-роксидазы хрена) с постоянным количеством кроличьего антиэст-радиола. В ячейки, покрытые антикроличьими IgG, добавляют стандарты, контроли и исследуемые пробы сыворотки, конъюгат эстрадиола-ПХ и кроличий антиэстрадиоловый реагент. Во время инкубации при комнатной температуре (18—25 °С) известное ко­личество меченного пероксидазой хрена эстрадиола конъюгирует с эндогенным эстрадиолом в стандарте, пробе и контроле за опреде­ленное число мест связывания на специфических антителах к эст-радиолу. При этом количество связанного меченного пероксида­зой эстрадиола обратно пропорционально содержанию эндогенно­го эстрадиола в исследуемой сыворотке.

Несвязанный конъюгат меченого эстрадиола отмывают из ячеек, добавляют хромогенный раствор и после развития голубой окраски добавляют стоп-раствор для остановки цветной реакции. Считыва­ние результатов проводят на ридере при длине волны 450 нм.

Реактивы: 96 микротитрационных ячеек, покрытых козьими антикроличьими IgG;

референс-стандарты эстрадиола, готовые к использованию — 6 флаконов по 0,5 мл с концентрациями 0,0, 10,0, 30,0, 100,0, 300,0 и 1000,0 пг/мл;

кроличий антиэстрадиоловый реагент (розового цвета) — 1 фла­кон (7 мл);

конъюгат эстрадиола и ПХ (голубого цвета) — 1 флакон (12 мл); эстрадиоловые контроли — 2 флакона по 0,5 мл с уровнями I и II. Готовые к использованию;

ТМБ-реагент — 1 флакон (11 мл);

стоп-раствор (кислота хлористоводородная) — 1 флакон (11 мл); деионизированная или бидистиллированная вода. Примечание. Все реагенты и пробы перед исследованием следу­ет привести к комнатной температуре (25 °С) и тщательно перемешать. Материал для анализа — сыворотка или плазма крови без гемолиза и липи-демии. Пробирку с кровью помещают в воду со льдом. Следует как можно быстрее отценгрифуги-ровать сыворотку или плазму, охладить до 4—8 "С или заморозить. Эстрадиол стабилен в сыворотке или плазме при 4—8 °С 1 день, при минус 20 °С — длительное время. Оборудование: микроплашечный иммуноферментный ана­лизатор (ридер); автоматическое промывающее устройство; полу­автоматические пипетки на 25, 50, 100, 200 мкл и 1,0 мл; фильтро­вальная бумага или бумажные салфетки для просушивания стри­пов; миллиметровая бумага.

Подготовка реагентов к анализу. Перед использованием все ре­агенты и пробы необходимо привести к комнатной температуре (18—25 °С). Сыворотки, в которых ожидается концентрация эстра-диола свыше 1000 пг/мл, следует предварительно развести разба­вителем сыворотки.

Ход определения. Закрепляют в штативе необходимое ко­личество ячеек. Вносят по 25 мкл стандартов, контролей и иссле­дуемых проб (в параллелях) в соответствующие ячейки. Добавляют в каждую ячейку по 100 мкл конъюгата эстрадиола-ПХ и по 50 мкл кроличьего анти-эстрадиолового реагента. Тщательно и аккуратно перемешивают в течение 30 с. Инкубируют при комнатной темпе­ратуре (18—25 °С) на протяжении 90 мин. При помощи автомати­ческого промывающего устройства исследуемые ячейки пятикрат­но промывают бидистиллированной водой. Остатки жидкости в ячейках удаляют, переворачивая и постукивая плашкой по филь­тровальной бумаге. Вносят в каждую ячейку по 100 мкл ТМБ-хро-могенного раствора, осторожно перемешивают в течение 5 с. Ин­кубируют при комнатной температуре (18—25 °С) 20 мин. Добав­ляют по 100 мкл стоп-раствора (кислоты хлористоводородной) в каждую ячейку. Осторожно перемешивают 30 с. Очень важно, чтобы голубая окраска полностью перешла в желтую. Считывают абсорбцию на ридере при длине волны 450 нм в течение 15 мин.

По полученным результатам стандартов строят калибровочную кривую и по ней определяют концентрацию гормона в исследуе­мых пробах сыворотки. При подсчете результаты предварительно разведенных образцов умножают на фактор разведения.

Клиническое значение. Эстрадиол — естественный эст­роген, секретируемый преимущественно яичниками и в незначи­тельных количествах корой надпочечников, у беременных плацен­той, у самцов семенниками. Эстрадиол обеспечивает развитие, диф-ференцировку и функциональную активность органов размножения самок, стимулирует рост и развитие фолликулов, повышает чувс­твительность яичников к действию гонадотропинов. Он ускоряет рассасывание желтых тел и наступление очередного полового цик-

ла. Под влиянием эстрадиола активируется влияние окситоцина на мышцы матки, повышается их сократительная функция, слегка от­крывается канал шейки матки во время половой охоты.

Количество эстрадиола в сыворотке (плазме) крови зависит от физиологического состояния животных. В период половой охоты коров оно колеблется в пределах 15—25 пг/мл (В. С. Шипилов с соавт., 1987) и доминирует над уровнем прогестерона, на 7-м ме­сяце стельности — 209,2 ± 11,6; на 8-м — 232,3 + 8,2 пмоль/л (Г. А. Черемисинов с соавт., 1990). Максимальный уровень эстра­диола наблюдался за 2—3 нед до родов, в период родов и в начале стадии полового возбуждения (А. Г. Нежданов с соавт., 1986). По данным Г. Г. Харуты (1999), содержание эстрадиола в сыворотке крови за 60—45 дней до отела можно использовать для прогнози­рования течения родов: при физиологическом течении оно состав­ляет 2,26 + 0,13 нмоль/л, а при последующей субинволюции — 1,37 ± 0,38 нмоль/л.

У кобыл в начале половой охоты количество 17(3-эстрадиола со­ставляет 42,05 + 5,94 пг/мл, через 12 ч после овуляции — 23,61 ± 3,14, через 2 дня после окончания стадии полового возбуждения содержа­ние гормона уменьшается до 13,26 ± 2,34 пг/мл, на 6—8-й день оно составляло 10,75 + 2,97, на 11—14-й день полового цикла — 26,7 ± 3,18; на 17-18-й день - 16,0 + 1,59 пг/мл (Д. В. Подвалюк, 1997). В первые 3 мес жеребности количество эстрадиола состав­ляет 46,1 ± 10,37 пг/мл; на 5—11-й месяц — уменьшается с 44,46 ± 7,11 до 16,6 ± 3,08 пг/мл, в период родов содержание эстрадиола составляет 17,0 ± 5,93 пг/мл (Д. В. Подвалюк, 1997).

Изложенные методы иммуноферментного определения гормо­нов апробируют В. В. Сахнюк, О. К. Голуб в Белоцерковском го­сударственном аграрном университете под руководством академи­ка УААН В. И. Левченко.

Условия подготовки образцов крови к определению гормонов изложены в справочном пособии «Обеспечение качества лаборатор­ных исследований. Преаналитический этап». (М.: Юнимед-пресс, 2003. - С. 206-246).