разделения методом ТСХ и денситометрии. Получаем поправоч­ный коэффициент (табл. 27).

Аналогичный поправочный коэффициент можно рассчитать и для подклассов фосфолипидов. Хроматограммы, полученные на стекле, можно записывать только на сканиметре. Сначала прово­дят запись одной пробы, затем другой и т. д., постепенно передви­гая пластинку под лучом проходящего света. Результаты регистри­руют в процентах.

Для каждого прибора и (или) режима исследований должны быть выведены свои поправочные коэффициенты.

Источник: 6.

3.3.6.5. Определение жирнокислотного состава липидов методом газожидкостной хроматографии (гжх)

Принцип. В основе метода ГЖХ лежат физико-химические свойства летучих соединений по-разному распределяться между двумя фазами: подвижной (инертный газ) и неподвижной (жид­кой), нанесенной на поверхность порошкообразного твердого но­сителя определенного зернения и определенных адсорбционных свойств, где она распределяется в виде тонкой пленки с большой поверхностью и служит растворителем. Компоненты анализируе­мой смеси (смесь метиловых эфиров жирных кислот), перемеща­ясь по колонке с помощью газа-носителя, распределяются между газовой и жидкой средами и в соответствии с их коэффициентом распределения селективно удерживаются неподвижной жидкой фазой до тех пор, пока не образуется определенная зона (концен­трация) в газе-носителе. Зоны отдельных жирных кислот последо­вательно выносятся из колонки газом-носителем, попадают в де­текторное устройство, вызывают электросигнал, который регист­рируется самописцем в виде пика и (или) цифрового изображения.

Реактивы: инертные носители неподвижной фазы для хро-матографической колонки: хромосорбы W, Р, G и Т, хромотой N, це­лит 545 и др. с величиной частиц 40/60, 60/80, 80/100 и 100/120 меш;

жидкие фазы, полярные и неполярные, которые должны обла­дать следующими свойствами (табл. 28);

ацетон; хлороформ; гексан; бензол; диэтиловый эфир; соляная кислота (ч. д. а.); метанол; петролейный эфир; безводная смесь Na2S04 и NaHC03 (2 : 1); стандартная смесь метиловых эфиров жирных кислот; метилирующая смесь: 0,5 н. раствор натрия мети-лата (CH^ONa), или 0,3 н. хлористый водород в абсолютном мета­ноле, или 0,3%-ный раствор серной кислоты (H2SO4) в абсолют­ном метаноле.

Оборудование: газожидкостный хроматограф отечест­венного или зарубежного производства. Прибор состоит из: а) хро-матографической колонки (металлической или стеклянной), со­держащей неподвижную фазу, в которой на входе располагается камера ввода анализируемого материала, а на выходе — детектор; б) термостатической камеры, обеспечивающей стабильную задан­ную температуру для хроматографической колонки; в) самописца; г) баллонов с газом-носителем, водородом и воздухом (для горю­чей смеси);

микрошприцы (марки Гамельтона) отечественного или зару­бежного производства для введения анализируемого материала в камеру — испаритель хроматографа; запасные хроматографиче-ские колонки; расходометр — для определения скорости поступле­ния газа-носителя, водорода, воздуха; силиконовые прокладки для герметизации колонок; пробирки с притертыми пробками на 10 мл; пипетки на 1, 2, 5 и 10 мл; пипетки бактериологические; груша ре­зиновая (малая); стеклянные ампулы на 10 и 15 мл; колба Бунзена.

Ход определения. После установки и наладки всех (электронных и механических) систем прибора, что выполняется специально подготовленными инженерами, его подготавливают к работе в соответствии с целью и задачами исследований. В подго­товительную работу входит: подготовка хроматографической ко-

28. Свойства жидких фаз

Жидкая фаза	Максимальная рабочая температура, 'С	Растворитель
Диэтиленгликольсукцинат (полярная)	190	Ацетон
Диэтиленгликольадипат (полярная)	190	Хлороформ
Полиэтиленгликольсукцинат (полярная)	200	Хлороформ, ацетон
Полиэтиленгликольадипат	200	Ацетон, хлороформ
Апиезон D (неполярная)	300	Хлороформ

лонки; выбор режима работы прибора и подготовка метиловых эфиров жирных кислот для их разделения.

Подготовка колонки. Эффективность разделения эфиров жир­ных кислот в значительной степени определяется качеством под­готовки хроматографической колонки: ее внутренним диаметром, длиной и качеством набивки (носителем и жидкой фазой). Чаще всего используют металлические колонки (они надежнее стеклян­ных) с внутренним диаметром 3—5 мм и длиной от 1 до 3 м. Пред­варительно колонка должна быть тщательно промыта и высушена. Для промывки применяют чистые, профильтрованные реагенты в следующем порядке:

1) 1%-ный раствор поверхностно-активных веществ типа ОП-7, ОП-10, ТВИН-60 или ТВИН-80 в дистиллированной воде (трех- кратно);

2. дистиллированную воду (трехкратно);

3. ацетон или метанол (двукратно);

4. бензол (двукратно);

5. диэтиловый спирт (двукратно);

6) растворитель, в котором будет растворяться неподвижная жидкая фаза (трехкратно).

После этого колонку продувают азотом и помещают в сушиль­ный шкаф при температуре 70—80 °С на 1 ч.

Готовят наполнитель для колонки. Для этого подбирают соот­ветствующую жидкую фазу и 5—15 % ее наносят на выбранный инертный носитель. Необходимое количество жидкой фазы (на­пример, 10 г), растворенной в соответствующем растворителе (хло­роформ или ацетон), вносят в круглодонную колбу со шлифом и туда же добавляют определенное количество (например, 100 г) твердого носителя. Колбу присоединяют к роторному испарителю и при вращении выпаривают растворитель полностью. Инертный носитель, пропитанный жидкой фазой, раскладывают тонким сло­ем на фильтровальной бумаге и подсушивают под вытяжным шка­фом, а затем в термостате при 80—100 "С до хорошо выраженной сыпучести. В таком виде наполнитель готов для использования.

Колонку заполняют следующим образом. Один конец закрывают стеклянной ватой (на глубину 0,7—1,5 см) и присоединяют к вакуум­ному насосу, а к другому присоединяют воронку (через резиновую трубку). Наполнитель засыпают через воронку при постоянном пос­тукивании палочкой до тех пор, пока колонка не заполнится полно­стью, после чего открытый конец закрывают стеклянной ватой. На­полнитель должен заполнить колонку достаточно плотно, без пустот. Для его уплотнения колонку можно присоединить к баллону с азотом и на 1—2 мин пустить с напором газ, постоянно постукивая палочкой.

После этого колонку вставляют в хроматограф и подвергают «тре­нировке», которая сводится к прогреванию ее в течение 15—20 ч при температуре несколько более высокой, чем та, при которой она будет работать, но ниже допустимой для данной жидкой фазы. В против­ном случае последняя улетучивается. Во время прогревания колонки через нее пропускают слабый поток газа-носителя (5—10 мл/мин). При этом второй конец колонки, обращенный к детектору, не при­соединяют, чтобы исключить загрязнение последнего.

После завершения «тренировки» колонки нагреватель термостата выключают, охлаждают до комнатной температуры, не выключая га­за-носителя, что предупреждает конденсацию влаги внутри колонки при охлаждении. Затем колонку присоединяют к детектору, прибор включают и выводят на рабочий режим, на котором предусматривает­ся разделение метиловых эфиров жирных кислот. В рабочий режим прибора входят следующие параметры: температура, скорость подачи газа-носителя, водорода и воздуха. От правильной установки и подде­ржания режима работы зависит качество разделения жирных кислот.

Выбор режима работы прибора. Для каждой марки хроматографа устанавливают свой режим, но чаще всего такой: температура колонки 160—190 "С, испарителя 220—240 °С, поток газов: носителя — 30— 75 мл/мин, водорода — 40—60 и воздуха — 300—400 мл/мин. Для ста­билизации режима работы прибор включают и прогревают при задан­ной температуре 1,5—2 ч. До прогревания прибора следует убедиться, что в газовой системе нет утечки газов. Для этого все контакты колон­ки с баллонами и прибором смазывают мыльной пеной. После про­гревания нужно убедиться в стабильности температуры термостата и базисной линии самописцев. С этой целью в колонку 2—3 раза вводят микродозы (1—3 мкл) хлороформа или гексана, для чего пользуются специальными микрошприцами вместимостью от 1 до 10 мкл.

Приготовление метиловых эфиров жирных кислот. Поскольку жирные кислоты нелетучие соединения, их перед введением в хро­матограф следует перевести в летучие — метиловые эфиры. Приво­дим два наиболее удобных и быстро выполнимых способа метили­рования жирных кислот.

1. Липидный экстракт в дозе, соответствующей 5—20 мг чистых липидов, вносят в пробирку с притертой пробкой и выпаривают рас­творитель струей азота. В пробирку добавляют 2 мл 0,5 моль/л на­трия метилата, закрывают и оставляют стоять при комнатной темпе­ратуре 30—40 мин или подогревают на песочной бане до 50—55 °С. Реакцию останавливают добавлением 0,2 мл 6 моль/л раствора НС1.

Затем в пробирку вносят 4 мл петролейного эфира и 4 мл дис­тиллированной воды, закрывают и содержимое энергично встря­хивают, дают отстояться и с помощью бактериологической пипет­ки с резиновой грушей верхний петролейный слой переносят в пе-нициллиновый флакон с сульфат-карбонатной смесью и сушат 10 мин. После этого петролейный эфир и растворенные в нем ме­тиловые эфиры переносят в короткую пробирку с притертой про­бкой, петролейный эфир удаляют струей азота, а оставшиеся ме­тиловые эфиры растворяют в 2—3 каплях хлороформа, гексана, се­роуглерода или в другом подходящем растворителе и с помощью шприца вводят в хроматограф (0,5—1 мкл).

2. В ампулу вносят 5—20 мг липидов, раствор испаряют струей азота и добавляют 2 мл метилирующей смеси (0,3 н. раствор хло­ристого водорода или 3%-ный раствор серной кислоты в абсолют­ном метаноле). Ампулу запаивают на газовой горелке и помещают в термостат на 1—2 ч при температуре 105 °С. После охлаждения содержимое ампулы небольшими порциями переносят на бумаж­ный фильтр и быстро просушивают под феном. Затем фильтр сги­бают на угол и метиловые эфиры осторожно смывают гексаном (5—6 мл) в пробирку. Гексан удаляют струей азота (при 45—50 °С) до минимума, а сконцентрированные метиловые эфиры (соломен­ного цвета) используют для анализа.

Примечания. Метилирующие смеси в лабораторных условиях готовят следующим образом:

1) для приготовления 0,5 моль/л раствора натрия ме- тилата (CH₃CONa) осторожно растворяют 2,299 г металлического натрия в 100 мл абсолютного мета- нола;

2. для приготовления 3%-ного раствора серной кислоты 1,63 мл H2SO4 (ч. д. а.) растворяют в 100 мл абсолютного метанола;

3. для приготовления 0,3 н. хлористого водорода поступают следующим образом. В колбу Бунзена на 0,5 или 1 л вносят 200—250 г натрия хлорида (NaCl), закрывают ее корковой или резиновой пробкой с отверстием, в которое вставляют дели­тельную воронку на 200 мл, наполненную концен­трированной серной кислотой (100—150 мл). По мере вливания (по каплям) кислоты в колбу с натрия хлоридом происходит реакция с выделе­нием газообразного хлористого водорода, который через резиновый шланг, надетый на боковой от­росток колбы и заканчивающийся стеклянной пи­петкой, отводят во флакон с метанолом (через ре­зиновую пробку), насыщая его до указанной выше концентрации. По завершении реакции в колбоч­ку отбирают 10—15 мл метанола, вносят 1—2 кап­ли индикатора Ташира и титруют 0,1 н. раствором NaOH для определения концентрации НО;

4. если метиловые эфиры или липиды требуют хранения, то их следует продуть азотом, ампулы запаять, а пробирки закрыть пробками и залить парафином. Поместить в герметически закрываю­щуюся емкость и хранить в холодильнике;

5. если ставится цель изучить жирнокислотный со­став отдельных классов липидов (фосфолипидов, триацилглицеринов, НЭЖК, эфиров холестерина) или подклассов фосфолипидов, то предваритель­но их разделяют методом ТСХ на стеклянной пластинке (для количественного анализа). Экстра­гируют определенным растворителем и метилиру­ют любым указанным выше способом.

Разделение, идентификация жирных кислот и расчет площади их пиков. Пробу метиловых эфиров жирных кислот вводят в колонку специальным микрошприцем через самоуплотняющуюся резино­вую мембрану инжектора путем быстрого нажатия на поршень. Ес­ли предусматривается получить только процентное соотношение жирных кислот в пробе, то точность объема вводимой пробы не имеет значения (однако он должен быть оптимальным). При ка­либровке прибора объем пробы должен быть точно измерен.

Как указывалось выше, смесь метиловых эфиров, проходя по ко­лонке с газом-носителем, селективно удерживается жидкой фазой и распределяется в колонке по мере увеличения длины их углеродной цепи. Выходя из колонки, метиловые эфиры отдельных жирных кис­лот попадают в детектор и изменяют в нем электропроводность.

В настоящее время в лабораторной практике наибольшее при­менение получили газожидкостные хроматографы с пламенно-ио­низационными детекторами и детекторами по теплопроводности (катарометрами).

Принцип работы ионизационных детекторов основан на том, что электропроводность газа прямо пропорциональна концентра­ции в нем заряженных частиц. Жирная кислота, выходящая из ко­лонки в виде газа, смешивается с водородом и сжигается в атмос­фере воздуха или кислорода. Ионы и электроны, образованные в пламени, попадают в межэлектродное пространство, уменьшают его сопротивление, в результате чего во внешней цепи возникает ток (электросигнал). Последний через усилитель регистрируется самописцем в виде соответствующих пиков.

Пламенно-ионизационный детектор чувствителен фактически ко всем соединениям, за исключением Не, Аг, Кг, Ne, Хе, 0₂, Cs₂, COS, SiHCl₃, SiF₄, H₂S, S0₂, NO, N₂0, N0₂, NH₃, CO, C0₂, H₂0, SiC^.

Принцип работы детектора по теплопроводности основан на том, что нагретое тело теряет тепло со скоростью, зависящей от состава окружающего газа, поэтому скорость теплоотдачи используется здесь для определения состава газа. Основным элементом катарометра слу­жит металлическая нить, скрученная в спираль и расположенная внутри камеры в металлическом блоке. Нить нагревают, пропуская через нее постоянный ток. Температура нити определяется равнове­сием, устанавливающимся между входной электрической мощностью (IB) и мощностью тепловых потерь, связанных с отводом тепла ок­ружающим газом. При пропускании через детектор чистого газа-но­сителя потеря тепла постоянная, поэтому температура нити также постоянная. При наличии в газе-носителе анализируемого вещества температура нити изменяется, что вызывает соответствующее изме­нение электрического сопротивления, передающегося на самописец.

Пламенно-ионизационный детектор во много раз чувствитель­нее катарометра.

В тех случаях, когда проба анализируемого вещества растворена в хлороформе или гексане, через несколько секунд после ее введе­ния в колонку сигнал детектора от растворителя регистрируется резким сдвигом пера самописца, а после ее выведения возвраща­ется обратно до или почти до базисной линии. Если в качестве рас­творителя используется сероуглерод, то сигнал не регистрируется.

Через несколько секунд или минут самописец начинает записы­вать сигналы, обусловленные выходом метиловых эфиров жирных кислот, начиная с самых коротких (6 : 0, 8 : 0, 10 : 0) и кончая са­мыми длинными (20 : 4, 22 : 0 и т. д.).

При разделении жирных кислот на полярных жидких фазах сначала выходят насыщенные, затем ненасыщенные, а на непо­лярных фазах, наоборот, сначала выходят ненасыщенные, а затем насыщенные жирные кислоты.

Время от момента введения пробы в колонку до момента выхо­да той или иной кислоты называется временем относительного удерживания. Установлено, что время относительного удержива­ния очередной кислоты по сравнению с предыдущей увеличивает­ся на величину, равную 1,56. Величины времени удерживания ис­пользуются для идентификации пиков.

Некоторые жирные кислоты имеют близкое время относительного удерживания, однако у каждой из них только одно определенное вре­мя удерживания, не зависящее от присутствия других компонентов.

При соблюдении режима работы хроматографа (температура и скорость потока газов) воспроизводимость времени удерживания может составлять 99—100 %.

Д анные по относительному времени удерживания метиловых эфиров жирных кислот на полярной и неполярных фазах при раз­ных температурах приведены в таблице 29. От полярности фазы в значительной степени зависит качество разделения анализируемых смесей жирных кислот.

Д ля разделения метиловых эфиров жирных кислот, полярных соединений (фосфолипидов, свободных жирных кислот, холесте­рина, сфингомиелинов, а также жирных кислот общих липидов) обычно используют полярные фазы, а для разделения неполярных соединений (триацилглицеринов) — неполярные.

В зависимости от длины колонки, скорости потока газа-носи­теля и рабочей температуры время разделения смеси эфиров жир­ных кислот занимает от 40 до 60—70 мин. Чем короче колонка, вы­ше температура и скорость потока газа-носителя, тем меньше время анализа. Однако при уменьшении длины колонки и повышении скорости газа-носителя разделение отдельных жирных кислот резко ухудшается. Поэтому длина колонки, скорость потока газа и темпе­ратура должны быть оптимальными, что определяется качеством разделения. Чаще всего используют колонки длиной 1,5—2,5 м.

Идентификацию пиков жирных кислот на хроматограммах луч­ше всего проводить по стандартным смесям химически чистых ме­тиловых эфиров жирных кислот. При этом следует начинать за­пись с простых смесей, содержащих 2—3, а затем 4—5 и больше жирных кислот, увеличивая их набор до максимума.

При отсутствии набора метиловых эфиров жирных кислот идентификацию проводят с помощью относительного времени удерживания отдельных жирных кислот, исходя из литературных данных (см. табл. 29).

Конечный результат разделения проб — определение абсолют­ного и относительного содержания в них отдельных жирных кис­лот. Оба эти расчета делают на основе установления площади того или другого пика, а также суммы площадей всех пиков. Поэтому правильное определение площади пика крайне важно. Существует несколько способов их вычисления на хроматограмме: 1) умноже­нием высоты пика на ширину на половине его высоты (в мм); 2) вырезанием пиков и взвешиванием их (бумаги) на аналитиче­ских весах; 3) путем умножения высоты пика (мм) на относитель­ное время удерживания кислоты в колонке хроматографа.

Наиболее признанным стал последний способ. За высоту пика с округлой вершиной берут точку пересечения двух линий, прове­денных от базисной линии касательно боковых сторон пика. По­лученную высоту (мм) умножают на время удерживания данного пика, которое определяется по расстоянию (мм) от момента введе­ния пробы (первая реакция самописца) до центра (или верхушки) пика. Метод прост и дает точные результаты. Затем рассчитанные площади пиков суммируют (100 %) и рассчитывают долю (%) каж­дого пика (кислоты). При этом следует внести поправку на чувс­твительность детектора.

Первые пики, выходящие на самописце, обычно записывают на самой высокой чувствительности (это кислоты от 6 : 0 до 16 : 1— 17 : 1). Затем чувствительность загрубляют 2—8 раза (все зависит от концентрации метиловых эфиров и характера пробы) до выхода наиболее больших по размеру пиков (от 18 : 0 до 18 : 2). Затем чувствительность вновь повышают до максимума и на ней закан­чивают запись остальных жирных кислот (от 18 : 3 до 20 : 4—22 : 0) (см. табл. 29). Если проводится анализ жирных кислот в липидах морских рыб, то после бегеновой кислоты (22 : 0) выходят 22 : 1, 22 : 5, 22 : 6, т. е. эруковая, докозапентаеновая и декозагексаеновая кислоты соответственно.

Поэтому нельзя отключать самописец ранее чем через 50—60 мин, а иногда выжидают и больше. Исследователь должен быть уверен, что все метиловые эфиры из анализируемой пробы вышли из колонки. Иначе колонка будет загрязняться и ухудшит разделение жирных кислот.

Если необходимо определить абсолютное количество жирных кислот, содержащихся в анализируемой пробе, то полученную площадь каждого пика умножают на поправочный коэффициент. Для этих целей готовят растворы жирных кислот известной кон­центрации (например, 5—10 мг/мл) в гексане или хлороформе и известное (точно!) количество вводят в колонку. После неод­нократного повторения выводят среднюю величину площади пика той или иной кислоты. Такие средние величины, полученные для разных доз, позволяют вывести графическую зависимость площади пика от дозы кислоты (табл. 30).