44. Приготовление растворов

№ пробирки

1

2 3 4 5

Стандартный раствор альбумина, мл

0,05

0,1

0,2

0,5

•,0

0,9%-ный раствор на­трия хлорида, мл

9,95

9,9

9,8

9,5

9,0

Концентрация бел­ка, г/л

0,05

0,1

0,2

0,5

1,0

Калибровочная кривая линейна до концентрации 1 г/л. Мочу с более высокой концентрацией белка разводят водой и при расчетах учитывают степень разведения. Этот метод непригоден для опре­деления белка в моче, содержащей контрастные вещества, боль­шое количество мочевой кислоты.

Концентрацию белка в моче можно определять биуретовым ме­тодом (см. Исследование крови).

Клиническое значение. Различают протеинурию прере-нальную, связанную с усиленным распадом белка тканей (парали­тическая миоглобинурия), выраженным гемолизом (гемоспориди-озные болезни, отравления гемолитическими ядами); ренальную, обусловленную патологией почек, которая разделяется на клубоч-ковую и канальцевую; постренальную, связанную с патологией мочевыводящих путей.

Появление в моче большого количества белка обусловлено пре­жде всего повышением фильтрации белков через клубочковый ка­пиллярный фильтр, а также снижением их канальцевой реабсорб-ции. Протеинурия, связанная с нарушением клубочковой проница­емости (клубочковая протеинурия), наблюдается при большинстве заболеваний почек — первичных и вторичных гломерулонефритах, вторичном амилоидозе почек, диабетическом гломерулосклерозе, тромбозе почечных вен, атеросклеротическом нефросклерозе. Вре­менная, коротко протекающая протеинурия наблюдается при ли­хорадочных и острых токсических поражениях почек.

Длительная протеинурия характерна для хронического гломеру-лонефрита, вторичного амилоидоза почек; может наблюдаться ме­сяцами и годами.

Функциональная протеинурия наблюдается при беременности, большой физической нагрузке, перегревании, переохлаждении, дегидратации, стрессе. Она связана с влиянием этих факторов на почечную гемодинамику, в результате чего повышается проницае­мость гломерулярных капилляров. Она исчезает после устранения причин, ее вызывающих. Канальцевая протеинурия — результат нарушения процессов реабсорбции белков первичной мочи (уль­трафильтрата). Она характерна для хронических интерстициаль­ных нефритов, вызванных отравлением солями свинца, ртути, ос­трой почечной недостаточностью.

Смешанная протеинурия обусловлена сочетанием гломеруляр-ных и тубулярных механизмов, имеющих место при гломеруло-нефритах, диабетической нефропатии, пиелонефрите и вторичном амилоидозе почек.

Инфраренальная (секреторная) протеинурия обусловлена по­вышенной секрецией разных белков клетками тубулярного эпите­лия, а также слизистой оболочкой и железами мочеполовых орга­нов, наблюдаемой при пиелонефрите, интерстициальном нефрите, простатите. Протеинурия сочетается с патологическими изменени­ями осадка мочи.

Обнаружение билирубина. Для обнаружения билирубина в моче используют пробы Фуше, Розина, Готфрида, полоски Билуген-тест и др. Образцы утренней мочи оберегают от действия прямого сол­нечного света. Обнаружение билирубина в моче в большинстве проб основано на его превращении под действием окислителя в зе­леный биливирдин или другие соединения определенного цвета.

Проба Фуше. Принцип. Метод основан на окислении били­рубина железа хлоридом в биливирдин и появлении зеленова­то-синего или голубоватого окрашивания.

Реактивы: 15%-ный раствор бария хлорида;

реактив Фуше. 25 г трихлоруксусной кислоты растворяют в - 100 мл дистиллированной воды и приливают 10 мл 10%-ного рас­твора хлорного железа (FeCy.

Ход определения. К 10—12 мл мочи прибавляют 5 мл 15%-ного раствора бария хлорида, смешивают, фильтруют. На выну­тый из воронки и расправленный на сухой фильтровальной бумаге или в чашке Петри фильтр наносят 2—3 капли реактива Фуше. По­явление на фильтре сине-зеленых пятен свидетельствует о при­сутствии билирубина. Если реакция мочи щелочная, то необходи­мо подкислить ее несколькими каплями уксусной кислоты.

Проба Розина. Реактив: 1%-ный спиртовый раствор йода.

Ход определения. В пробирку наливают 4—5 мл мочи и осторожно по стенкам пробирки наслаивают раствор йода. По­явление на границе между жидкостями зеленого кольца свидетель­ствует о наличии билирубина.

Проба Готфрида. Принцип. Связанный с глюкороновой кис­лотой билирубин при соединении с диазотированной сульфаниловой кислотой (циазобензосульфоновая кислота) дает розовую окраску.

Реактивы: 10%-ный раствор хлорида бария;

диазореактив: а) диазораствор I: 5 г сульфаниловой кислоты растворяют в небольшом количестве воды, прибавляют 15 мл кон­центрированной НС1 и доливают до 1000 мл дистиллированной во­дой; б) диазораствор II: 0,5%-ный раствор натрия нитрата. Непос­редственно перед определением смешивают 10 мл диазореактива I и 0,25 мл диазореактива II;

96%-ный спирт этиловый;

6%-ный раствор двузамещенного натрия фосфата.

Ход определения. К 10 мл мочи, подкисленной несколь­кими каплями уксусной кислоты, прибавляют 5 мл 10%-ного рас­твора бария хлорида, перемешивают, фильтруют через бумажный фильтр. Фильтр раскладывают на дне чашки Петри и на осадок ка­пают 1—2 капли свежеприготовленной диазосмеси, 4 капли спирта и 1 каплю двузамещенного натрия фосфата. При наличии в моче билирубина появляется красно-фиолетовая окраска.

Примечание. Мешают обнаружению билирубина высокие кон­центрации в моче уробилиноидов, индикана, нит­ритов, аскорбиновой кислоты, фенотиозина.

Тест на билирубин с использованием полосок Билуген-тест или мультитестовых полосок. Основан на соединении билирубина со стабильной солью диазония (2,6-дихлорбензендиазония флуобо-рат) в кислой среде с образованием красно-фиолетового окраши­вания. Цвет изменяется до фиолетового, причем интенсивность нарастает соответственно концентрации билирубина. Предел чувс­твительности — 0,5 г/100 мл (9 мкмоль/л) билирубина в моче, не содержащей аскорбиновой кислоты.

Оценка реакции. Наличие билирубина в моче дает переход окраски от белой к розово-бежевой или светло-красно-фиолето­вой. Легкое розовое окрашивание принимается за положительную пробу. Другие компоненты мочи, дающие желтоватую окраску, могут слегка изменять оттенок окрашивания. Сравнение окраши­вания по шкале: — отрицательный результат; н— слабоположитель­ный; ++ умеренно положительный; +++ сильно положительный результат.

Примечание. Длительное хранение мочи, особенно на свету, вы­зывает окисление билирубина и ложноотрицатель-ные результаты. Ложноположительные результаты могут быть вызваны лекарствами, окрашивающими мочу в красный цвет. Клиническое значение. У здоровых животных билиру­бин в моче качественными пробами не обнаруживают. При болез­нях печени и желчных путей в моче появляется билирубинглюкоро-нид (связанный с глюкороновой кислотой билирубин — водораство­римый). Билирубинурию наблюдают при гепатите (паренхиматозная желтуха), застое желчи в желчном пузыре и желчных протоках — хо-лестазе (желчнокаменная болезнь, холецистит). Так как несвязан­ный (непрямой) билирубин водонерастворимый и не проходит через почечный фильтр, то для гемолитической желтухи (гемоспоридиоз-ные болезни, отравления гемолитическими ядами) билирубинурия не характерна.

Обнаружение и определение уробилиноидов (уробилина, уробили-ногена). Проба Флоренса. Принцип. С кислотой хлористоводо­родной уробилин образует соединение, окрашенное в красный цвет.

Реактивы: серная кислота концентрированная; диэтиловый эфир; кислота хлористоводородная концентрированная.

Ход определения. В пробирку вносят 8—10 мл мочи, под­кисляют 8—10 каплями концентрированной серной кислоты, пе­ремешивают, затем приливают 2—3 мл эфира, закрывают пробкой, несколько раз осторожно пропускают эфир через слой мочи для экстрагирования уробилина. Затем эфирную вытяжку мочи насла­ивают лучше пастеровской пипеткой на 2—3 мл концентрирован­ной кислоты хлористоводородной и помещают в другую пробирку. При наличии уробилина на границе жидкости образуется розовое кольцо. Проба очень чувствительная.

Проба Богомолова. Принцип. Уробилин с меди сульфатом образует соединение красно-розового цвета.

Реактивы: насыщенный раствор меди сульфата (C11SO4 х х 5Н2О, ч. д. а.). 23 г вещества растворяют в 100 мл дистиллиро­ванной воды;

хлороформ.

Ход определения. В пробирку вносят 10—15 мл мочи, 2—3 мл насыщенного раствора меди сульфата. При появлении по­мутнения прибавляют несколько капель концентрированной кис­лоты хлористоводородной до просветления смеси. Через 5 мин приливают 2—3 мл хлороформа, пробирку закрывают пробкой и несколько раз встряхивают. При окрашивании хлороформа в розо­вый цвет реакция положительная.

Примечание. Обнаружению уробилиноидов мешают билирубин и гемоглобин. В случае их нахождения в моче ее пред­варительно готовят следующим образом. К 10— 12 мл мочи добавляют 5—6 мл 10%-ного раствора бария хлорида (ВаОг) и фильтруют. Затем фильтрат проверяют на полноту осаждения билирубина. Процедуру повторяют до полного осаждения би­лирубина.

Проба Нейбауера. Принцип. Проба основана на реакции между уробилиногеновыми телами и реактивом Эрлиха с образо­ванием соединения красной окраски.

Реактив: реактив Эрлиха: 2 г иара-диметиламинобензальдеги- да растворяют в 100 мл 20%-ного раствора кислоты хлористоводо- родной. •

Ход определения. К нескольким миллилитрам свежей ох­лажденной до комнатной температуры мочи прибавляют несколь­ко капель реактива Эрлиха. Окрашивание жидкости в первые 30 с свидетельствует о положительной пробе, а появление окраски по истечении 30 с — о нормальном количестве или отсутствии уроби-линогенов.

Обнаружение уробилиногена мультитестовыми полосками или Билуген-тестом. Принцип. Стабильная соль диазония (4-меток-сибензенедиазоний флиоборат) реагирует немедленно с уробили­ногеном в кислой среде с появлением окраски. Тест очень чувс­твителен; предел чувствительности 0,4 мг/100 мл (7 мкмоль/л). Другие вещества мочи не влияют на реакцию. Ложноположитель-ные результаты получают от присутствия в моче феназопиридина.

Присутствие в моче уробилиногена оценивается по изменению цвета от белого до красного через 10 с.

Клиническое значение. Уробилиногенные тела — про­изводные билирубина. Из попавшего в кишечник с желчью свя­занного билирубина под действием бактерий образуются уробили-нвиды (уробилиногены, уробилины, стеркобилиногены, стеркоби-лины). Уробилиноиды выделяются с калом, часть их реабсорбиру-ется из кишечника в кровь, через систему воротной вены поступает в печень и разрушается. Небольшое количество этих ве­ществ по системе геморроидальных вен, минуя печень, выделяется с мочой. Выделение уробилиноидов с мочой в большом количестве носит название уробилинурии (уробилиногенурия). Уробилину-рию отмечают при гепатите, циррозе печени, гемолитической ане­мии и других гемолитических состояниях, кишечной непроходи­мости, запоре.

Обнаружение крови и кровяных пигментов. Кровяные пигменты (гемоглобин, метгемоглобин, сульфгемоглобин, гемосидерин), ми-оглобин обнаруживают бензидиновой пробой, пробой с аммония сульфатом, тест-бумагой и др.

Бензидиновая проба. Принцип. Обнаружение кровяных пиг­ментов путем гемолиза эритроцитов и освобождение из него ге­моглобина, который способен отнимать водород от амидоперина, бензидина, гвояколовой смолы и других органических соединений и переносить его на пероксид водорода с образованием окрашен­ных соединений. Кровяные пигменты извлекаются эфиром.

Реактивы: этиловый эфир;

5%-ный раствор бензидина в ледяной уксусной кислоте; свежий пероксид водорода;

ледяная уксусная кислота; этиловый спирт.

Ход определения. Готовят эфирную вытяжку мочи: к 10—15 мл добавляют 2 мл ледяной уксусной кислоты, 8 мл этило­вого эфира и 1 каплю этилового спирта, взбалтывают и дают пос­тоять. К 2 мл эфирной вытяжки мочи добавляют 5 капель 5%-ного раствора бензидина в ледяной уксусной кислоте и 8—10 капель пе­роксида водорода. При наличии крови в моче раствор окрашива­ется в зеленый цвет.

Проба с гвояколовой смолой. Принцип. Тот же, как и в пре­дыдущем методе.

Реактивы: этиловый спирт;

свежеприготовленный насыщенный раствор гвояколовой смо­лы в этиловом спирте; пероксид водорода;

этиловый спирт.

Ход определения. Подготовка эфирной вытяжки мочи та­кая же, как указано в предыдущей пробе.

К 2 мл эфирной вытяжки мочи добавляют 6 капель спиртового свежеприготовленного насыщенного раствора гвояколовой смолы и 8 капель свежего пероксида водорода. Появление через 5—8 мин синего окрашивания свидетельствует о наличии в моче крови.

Обнаружение крови по тест-бумаге. Принцип. Тест основан на том, что гемоглобин и миоглобин катализируют окисление ок­рашенного индикатора с помощью органического пероксида водо­рода (2,5-диметил-2,5-дигидропероксигексан) с образованием си­не-зеленого окрашивания, которое кажется зеленым на желтой тест-бумаге. Неповрежденные эритроциты гемолизируются на тест-бумаге, гемоглобин осаждается и запускает реакцию, которая вызывает по соседству с каждым эритроцитом появление видимых зеленых точек.

Чувствительность пробы очень высокая — 5 эритроцитов в 1 мкл или количество гемоглобина, освобожденное из 10 эритро­цитов. Тест специфичен к гемоглобину и миоглобину.

Примечание. Нельзя применять формалин в качестве консерва­тора мочи. Протеинурия может уменьшить окрас­ку, вызванную гемоглобином.

Клиническое значение. Моча здоровых животных дает отрицательную реакцию на кровяные пигменты. Положительная реакция на них может быть в результате появления в моче крови, гемоглобина, миоглобина. Гематурия наблюдается при гломеруло-нефрите, мочекаменной болезни, цистите. Гемоглобинурию на­блюдают при гемолитических состояниях (кровопаразитарные бо­лезни, отравление гемолитическими ядами), тяжелых инфекцион­ных болезнях.

Проба на миоглобин. Принцип. Метод основан на осаждении гемоглобина аммония сульфатом и способности миоглобина при этом окрашиваться в красно-коричневый цвет.

Реактив: аммония сульфат кристаллический.

Ход определения. В 5 мл мочи растворяют 2,8 г аммония сульфата, смесь фильтруют. Если фильтрат приобретает красно-ко­ричневый цвет, значит, в моче имеется миоглобин, а если фильтрат не окрашен — присутствует гемоглобин.

Моча здоровых животных не содержит миоглобина. Появление миоглобина в моче наблюдается при паралитической миоглобину-рии, травмах мышц.

Обнаружение индикана. Проба Обермайера. В пробирку вносят 6 мл мочи и 6 мл раствора железа хлорида (0,2—0,4 г железа хло­ристого растворяют в 100 мл концентрированной соляной кисло­ты). Через 5 мин в пробирку добавляют 1—2 мл хлороформа, со­держимое встряхивают. При наличии индикана хлороформ в ниж­ней части пробирки окрашивается в синий цвет.

Проба Яффе. Реактивы: концентрированная серная кислота; хлороформ; 2%-ный раствор калия перманганата.

Ход определения. В пробирку вносят по 2—3 мл профиль­трованной мочи, концентрированной соляной кислоты и хлоро­форма и 1—2 капли 2%-ного раствора калия перманганата. Про­бирку несколько раз переворачивают. Оценивают реакцию после оседания хлороформа. При наличии индикана хлороформ окраши­вается в голубой или розовый цвет.

Клиническое значение. В моче здоровых животных ин-дикан содержится в небольшой концентрации, которую качествен­ными реакциями не обнаруживают. Повышенное содержание ин­дикана в моче (индиканурия) наблюдают при интенсивном гние­нии белков в кишечнике (копростаз, непроходимость кишечника и др.) или при распаде мышц и других тканей.

Обнаружение и определение глюкозы. Проба Гайнеса. Прин­цип. Метод основан на способности глюкозы восстанавливать в щелочной среде при нагревании гидрат оксида меди (синего цве­та) в гидрат закиси меди (желтого цвета) и закись меди (красного цвета). Чтобы из гидрата оксида меди не образовался черный оса­док оксида меди, к реактиву добавляют глицерин, который связы­вает гидрат оксида меди.

Реактивы: а) 13,3 г меди сульфата (CuS04'5H₂0, х. ч.) рас­творяют в 400 мл дистиллированной воды;

б) 50 г натрия (калия) гидроксида растворяют в 400 мл дистил- лированной воды;

в) 15 г глицерина (ч. или ч. д. а.) растворяют в 200 мл дистил- лированной воды.

Растворы «а» и «б» смешивают и тотчас же добавляют раствор «в». Реактив длительно сохраняется в холодильнике.

Ход обнаружения. Вариант 1. К 6—8 мл мочи прибавляют 20 капель реактива до появления голубоватой окраски, смешивают и нагревают верхнюю часть пробирки до начала кипения. Нижняя часть пробирки — контроль. При наличии глюкозы в верхней час­ти пробирки в моче появляется желтая окраска.

Вариант 2. В пробирку вносят 3—4 мл реактива, 8—12 капель мочи. Кипятят или нагревают до кипения. При наличии глюкозы в моче раствор становится желто-бурым. Чувствительность пробы около 0,03 %.

Глюкозу в моче можно определить специальными мультитести-рованными полосками. Обнаружение глюкозы основано на специ­фической глюкозо-оксидазно-пероксидазной реакции. Окраска изменяется от желтой (норма) через светло-зеленую в темно-зеле­ную. Чувствительность в образце мочи, не содержащей аскорбино­вой кислоты, около 40 мг/100 мл (2,2 ммоль/л). Результат сравни­вают со шкалой через 60 с.

Количественное определение глюкозы в моче. Определение глюко­зы в моче возможно по цветной реакции с ортотолуидином (см. Оп­ределение глюкозы в крови) или поляриметрическим методом.

Поляриметрический метод. Принцип. Метод основан на ис­пользовании свойства раствора глюкозы вращать плоскость поля­ризованного луча вправо. Угол вращения пропорционален кон­центрации глюкозы в растворе.

Реактивы: 30%-ный раствор свинца ацетата (свинец уксусно­кислый).

Оборудование: поляриметр.

Ход определения. Моча не должна содержать белок; если он имеется, то мочу кипятят и фильтруют. Мочу обесцвечивают: к 10 мл ее добавляют 1 мл 30%-ного раствора свинца ацетата, под­кисленного несколькими каплями уксусной кислоты, перемеши­вают и фильтруют. Исследование проводят в кислой среде, так как в щелочной свинец осаждает глюкозу. Глюкоза в моче стабильна при комнатной температуре и 4—8 °С в течение 2 ч, при минус 20 °С — в течение 48 ч.

Трубку поляриметра наполняют прозрачным фильтратом, избе­гая попадания пузырьков воздуха, накрывают шлифованным стек­лом, помещают в аппарат и через 2—3 мин проводят последующие операции, руководствуясь инструкцией к прибору. Работу прибора проверяют по свежеприготовленному раствору глюкозы с извест­ной концентрацией.

Примечание. Определению глюкозы в моче мешают В-оксимас-ляная кислота, стрептомицин, препараты тетрацик-линового ряда.

Клиническое значение. В моче здоровых животных кон­центрация глюкозы ничтожно мала и обнаружить или определить ее невозможно. Повышение содержания глюкозы в моче (глюко-зурия) отмечается при сахарном диабете, нарушении почечной фильтрации (почечная глюкозурия, «почечный диабет»), пораже­нии печени, стрессах, гипертиреозе и многих других патологиче­ских состояниях. Наибольшее клиническое значение имеет конт­роль глюкозы в моче при диагностике и лечении сахарного диабета.

Обнаружение кетоновых тел. У здоровых животных в моче со­держится незначительное количество кетоновых тел (В-оксимасля-ная и ацетоуксусная кислоты, ацетон), которое качественными ре­акциями не обнаруживается. Для обнаружения кетоновых тел в моче при их концентрации выше 10—12 мг/100 мл используют пробу Лестраде, Ланге, Ротера, экспресс-тест, кетур-тест, мульти-тестовые полоски, основанные на тесте Летала и др.

Принцип. Натрия нитропруссид в щелочной среде реагирует с кетоновыми телами, прежде всего с ацетоуксусной кислотой и ацетоном, с появлением окрашивания от сиреневого до темно-фи­олетового. При этом чем больше в моче ацетоновых тел, тем ин­тенсивнее окраска.

Проба Лестраде. Реактивы: 1 г натрия нитропруссида [Na₂(FeCN0₂)(CN)₅ • 2Н₂0];

20 г аммония сульфата [(N114)2804];

20 г натрия карбоната (1Ча₂СОз) безводного.

Компоненты мелко измельчают в фарфоровой ступке в одно­родный порошок, который помещают в склянку из темного стекла с пробкой. Хранят 1—2 мес.

Ход определения. Исследуют свежеполученную мочу на ферме или в лаборатории. На фильтровальную бумагу на кончике скальпеля наносят реактив и смачивают несколькими каплями мо­чи, через 30 с учитывают результат. Появление сиреневой, красной или темно-фиолетовой окраски свидетельствует о наличии в моче повышенной или высокой концентрации ацетоновых тел.

Проба Ланге. Реактивы: раствор натрия нитропруссида 5 г/100 мл. Готовят перед употреблением;

уксусная кислота концентрированная;

25 %-ный раствор аммиака водного (NH4OH).

Ход определения. Исследуют мочу не позже чем через 3 ч после ее получения. В пробирку вносят 3—5 мл мочи, приливают 5—10 капель раствора натрия нитропруссида и 0,5 мл уксусной кислоты, смешивают и осторожно по стенке пробирки пипеткой наслаивают 2—3 мл водного раствора аммиака. Пробу считают по­ложительной, если в течение 3 мин на границе сред образуется красно-фиолетовое кольцо.

Обнаружение кетоновых тел с помощью кетур-теста, мулътитес-товых полосок или специальных таблеток проводят по инструкции, прилагаемой к набору.

Экспресс-метод заключается в том, что таблетку помещают на фильтровальную бумагу и смачивают несколькими каплями мочи. Через 2 мин окраску таблетки сравнивают с цветной шкалой. На­личие ацетона вызывает фиолетовое окрашивание разной интен­сивности. Согласно шкале, реакцию оценивают как слабоположи­тельную, положительную и резко положительную.

При использовании кетур-теста и мультитестовых полосок в моче обнаруживают ацетоуксусную кислоту в концентрации 5 мг/100 мл и выше, ацетон 40—70 мг/100 мл и более. Положительной пробой считают изменение окраски от бежевой до фиолетовой. Сравнение со шкалой дает ориентировочную оценку содержания ацетоуксус­ной кислоты, равного: (+) — около 5—40 мг/100 мл; (++) — около 40-100 мг/100 мл; (+++) — 100 мг/100 мл и выше.

Клиническое значение. Кетоновые тела не имеют по­чечного порога и выделяются с мочой в степени, пропорциональ­ной нарастанию концентрации их в крови. Обнаружение кетоно­вых тел в моче является наиболее доступным и ранним тестом диа­гностики кетоза у коров, овцематок, буйволиц. При кетозе кон­центрация кетоновых тел в моче нарастает главным образом за счет ацетоуксусной кислоты и ацетона, которые вступают в реак­цию с натрия нитропруссидом. Наиболее высокая концентрация кетоновых тел в моче (около 800—1000 мг/100 мл) отмечается при остром тяжелом течении кетоза (И. П. Кондрахин). Кетоновые те­ла в моче в высокой концентрации обнаруживают при тяжелом те­чении сахарного диабета (кетоацидоз). Незначительное повыше­ние кетоновых тел в моче можно установить при задержании пос­леда, тяжелой хирургической инфекции и некоторых других пато­логических состояниях. При этом повышение кетоновых тел идет преимущественно за счет Р-оксимасляной кислоты.

Исследование мочевого осадка. Исследуют утреннюю порцию мочи. Готовят осадок путем центрифугирования 10 мл мо­чи 10 мин при 3000 мин . Надосадочную жидкость осторожно сливают, осадок переносят на предметное стекло и покрывают покровным, изучают вначале под малым увеличением микроскопа (8 х 10), а затем при большом увеличении (10 х 40), изучая фор­менные элементы крови, цилиндры, кристаллы солей.

Если исследование мочи нельзя провести в течение 20 мин пос­ле взятия, то в пробу добавляют консервант из расчета на 10 мл 0,5 мл уксусной кислоты, 1 кристалл тимола или 1 каплю 40%-но-го раствора формальдегида.

Выделяют организованный осадок, включающий эритроциты, лейкоциты, клетки эпителия, цилиндры и «неорганизованный» осадок, представленный кристаллическими образованиями (моче­вая кислота, ураты, кислый мочекислый аммоний, кальция фос­фат, гиппуровая кислота, магния-аммония фосфат, кальция кар­бонат, кальция оксалат, цистин, ксантин и др.).

Эритроциты. Неизмененные эритроциты имеют вид дисков зеле­новато-желтого цвета, измененные, свободные от гемоглобина, —

б есцветные, в виде одноконтурных или двухконтурных колец (рис. 4, 2—4). В моче низкой относительной плотности встречаются бесцветные эритроциты, высокой плотности — сморщенные. В моче здоровых живот­ных встречаются единичные эритро­циты (0—2 в поле зрения). Появление большего количества их называют ге­матурией. Она может быть обусловле­на выходом эритроцитов из почек — гематурия гломерулярного происхож­дения и из мочевыводящих путей при мочекаменной болезни, злокачествен­ных опухолях в мочевом пузыре. При гломерулярной гематурии в моче час­то содержится большое количество белка, при негломерулярной — его концентрация незначительна.

Лейкоциты. В моче щелочной реакции лейкоциты быстро раз­рушаются. В моче здоровых животных кислой реакции их количес­тво от 0 до 2 в поле зрения. Лейкоциты имеют вид небольших зер­нистых клеток округлой формы (см. рис. 4, 1). Увеличение коли­чества лейкоцитов в моче называют лейкоцитурией. Лейкоциты могут попадать в мочу из почек (пиелонефрит), мочевыводящих путей (цистит, уроцистит) или из всей мочевыводящей системы. Когда отмечают лейкоцитурию и выраженную протеинурию, гово­рят о ее почечном происхождении. Наибольшее количество лейко­цитов (50—100 и более в поле зрения микроскопа) отмечают при пиелонефрите, цистите. Однако степень лейкоцитурии при хрони­ческом пиелонефрите не всегда соответствует тяжести поражения. При затухании процесса, отсутствии выраженного воспаления ко­личество лейкоцитов в моче может оставаться в пределах нормы. Следует иметь в виду, что лейкоциты в мочу могут попадать из по­ловых органов (вагинит, эндометрит, простатит и др.).

Лейкоцитурию помимо микроскопии можно выявить экс­пресс-методом (метод Gadeholt). Принцип. При проведении пе-роксидазной реакции цитоплазма лейкоцита приобретает голубую или синюю окраску.

Реактивы: краситель — 300 мг диаминофлуорона и 130 мг флюксина В растворяют в 70 мл 96%-ного этилового спирта. К этой смеси добавляют 11 г натрия ацетата (NaC^COO • ЗН26), раство­ренного в 20 мл 0,5%-ной уксусной кислоты, и 1 мл 3%-ного пе-роксида водорода. Через 48 ч реактив фильтруют, хранят в темной посуде, периодически фильтруют.

Ход определения. 10 мл свежеполученной мочи фильтру­ют через фильтровальную бумагу, после чего на бумагу наносят 3 капли красителя. При содержании в 1 мкл мочи более 10 лейко­цитов на месте нанесения краски появляется темно-синее пятно. Про­ба считается отрицательной, если пятно красного цвета, и сомнитель­ной, если пятно голубого цвета. Этот метод выявляет скрытую лей­коцитурию.

Эпителиальные клетки. В осадке мочи можно встретить клетки плос­кого, переходного и почечного эпи­телия (рис. 5). Клетки плоского эпителия округлой или полигональ­ной формы, больших размеров, бес­цветные с небольшими ядрами. Они попадают в мочу из наружных по­ловых Органов И МОчеиСПуСКатеЛЬ- Рис. 5. Клетки эпителия в осадке мочи:

ного канала. Клетки переходного * - ^клетки плоского эпителия; 2 -

* ¹⁴ _ клетки переходного эпителия 3 — Эпителия ВЫСТИЛают СЛИЗИСТУЮ Обо- клетки почечного эпителия

18»

275

лочку мочевыводящих путей и их большое количество в моче гово­рит о воспалительном процессе в лоханке и мочевом пузыре. Эти клетки имеют различную форму и величину, круглое ядро. По ве­личине они меньше клеток плоского эпителия.

Клетки почечного эпителия имеют вид клеток округлой или многоугольной формы, мелкие (немного больше лейкоцитов), с крупным ядром и крупной зернистостью. Наличие клеток почеч­ного эпителия в моче — характерный признак гломерулонефрита, амилоидоза почек, лихорадочных состояний, интоксикаций.

Цилиндры. Это белковые или клеточные образования канальце-вого происхождения, имеющие цилиндрическую форму и различ­ную величину (рис. 6). В мочевом осадке встречаются гиалиновые цилиндры, имеющие нежные контуры и гладкую поверхность. Их обнаруживают при остром и хроническом нефрите, амилоидозе почек, физиологической протеинурии, дегидратации.

Зернистые цилиндры более резких контуров и состоят из плот­ной зернистой массы желтоватого цвета. Они возникают из рас­павшихся клеток эпителия канальцев почек и свидетельствуют о дистрофических процессах в канальцах.

Восковые цилиндры имеют резкие контуры и гомогенную структуру желтого цвета. Характерны для хронических заболева­ний почек.

Рис. 7. Неорганизованные осадки мочн:

Л 2— кальция карбонат; 3, 4— триппельфосфат (3— большое и 4— малое увеличение); 5—гиппуровая кислота; 6— аммония урат; 7—кальция оксалат; 8— кальция сульфат; 9, 10— кристаллы мочевой кислоты; //, 12— ураты

В моче могут встречаться эритроцитарные, эпителиальные, ге-моглобиновые, лейкоцитарные цилиндры, которые не имеют осо­бого клинического значения.

Неорганизованные осадки — соли, выпавшие в осадок в виде кристаллов или аморфных масс (рис. 7). Характер солей зависит от рН мочи, коллоидного состояния и других ее свойств. В кислой моче обнаруживают мочевую кислоту, ураты, оксалаты, гиппуро-вую кислоту, кальция сульфат. Мочевая кислота представляет со­бой полиморфные кристаллы, окрашенные в желтый цвет, легко растворимые в щелочах, но не растворимые в кислотах. Появляет­ся в осадке при высокой концентрации мочи, подагре, лейкозе.

Ураты — соли мочевой кислоты, мелкие зернышки, располо­женные в виде кучек, полос. Откладываются на цилиндрах и клет­ках эпителия. Растворяются при подогревании и прибавлении ще­лочи. Встречаются при лихорадке, поносе, усиленном потоотделе­нии, лейкозе.

Оксалаты — соли щавелевой кислоты (щавелевокислая известь) — бесцветные кристаллы в виде конвертов, четырехгранных призм. По­являются при скармливании скоту травы с заболоченных лугов или других угодий с кислыми почвами.

В щелочной моче встречаются кристаллы кальция карбоната (СаСОз) в виде бесцветных шаров с концентрической исчерчен-ностью. Чаще лежат парно (розетки, гири, скрещенные барабан­ные палочки). Растворяются при добавлении кислоты с выделени­ем пузырьков углекислоты.

Аморфные фосфаты (кальция фосфат, магния фосфат) — неокрашенные мелкие образования в виде шариков, лежащих раз­дельно или скоплениями.

При щелочной реакции мочи образуются, кроме того, кристал­лы магния-аммония фосфата. Неорганизованные осадки мочи особого диагностического значения не имеют.

Источники: 28, 29, 30.

4.3. ИССЛЕДОВАНИЕ КАЛА

Макроскопически определяют консистенцию, цвет, запах кала, остатки непереваренного корма, наличие слизи, прожилок крови, жира, гельминтов.

Микроскопически выявляют яйца и личинки гельминтов, про­стейших паразитов, используя соответствующие методы гельмин-тоскопии, гельминтоовоскопии и др.

Определение рН. Обычно используют лакмусовую бумагу, кото­рая изменяет свой цвет после контакта с фекальными массами в зависимости от концентрации в них ионов водорода (Н⁺-ионов). Универсальная лакмусовая бумага служит для измерения рН в диа­пазоне от 1,0 до 10,0. Лакмусовую бумагу смачивают дистиллиро­ванной водой, прикладывают к поверхности фекалий и отмечают изменение цвета, сравнивая с контрольной шкалой. Наиболее точ­ное определение рН кала проводят на рН-метре.

У здоровых животных реакция кала слабощелочная или ней­тральная. Она зависит от состояния кишечника, степени бродиль­ных или гнилостных процессов. При нарушении пищеварения в передних отделах пищеварительного тракта, плохом переварива­нии углеводов они подвергаются воздействию ферментов бродиль­ной микрофлоры кишечника с образованием органических кислот и углекислоты. рН кала сдвигается в кислую сторону, характеризуя бродильную диспепсию.

При застое содержимого в толстом кишечнике, активизации гнилостной микрофлоры реакция кала становится резко щелочной (гнилостная диспепсия).

Обнаружение крови. Принцип. Пигменты крови расщепляют пероксид водорода с освобождением атомарного кислорода, кото­рый окисляет вещества (бензидин, амидопирин, гвояколовую смо­лу), принимающие различную окраску.

Бензидиновая проба. Реактивы: 1%-ный раствор бензидина (NH2C6H4C6H4NH2) в 50%-ной уксусной кислоте. Хранят в посу­де из темного стекла в течение нескольких дней;

3%-ный раствор пероксида водорода (Н2О2).

Ход определения. Кал тонким слоем наносят на предмет­ное стекло. Мазок помещают в чашку Петри, лежащую на белой бумаге, и наносят на него по 2—3 капли раствора бензидина и пе­роксида водорода. При наличии в кале крови сразу же появляется зеленое или синее окрашивание. Если окраска не развивается или появляется позже 2 мин, то проба считается отрицательной. Проба очень чувствительна.

Гвояколовая проба. Реактивы: 2%-ная спиртовая настойка гвояколовой смолы;

ледяная уксусная кислота;

3%-ный раствор пероксида водорода.

Ход определения. Предметное стекло помещают в чашку Петри, покрывают фильтровальной бумагой, на которую наносят кал в виде мазка. На кал капают 2—3 капли ледяной уксусной кис­лоты, настойки гвояколовой смолы и пероксида водорода.

В присутствии крови появляется сине-зеленое или фиолетовое окрашивание.

Пирамидоновая проба. Реактивы: 5%-ный спиртовой раствор амидопирина (пирамидон);

30%-ный раствор уксусной кислоты; 3%-ный раствор пероксида водорода.

Ход определения. Кусочек кала растирают с 4—5 мл воды и фильтруют. К фильтрату добавляют равный объем раствора ами­допирина и 10—12 капель раствора уксусной кислоты и пероксида водорода. При наличии в кале крови в течение 2 мин появляется сине-фиолетовое окрашивание. Если через 2 мин окраска не раз­вилась, то проба считается отрицательной.

Экспресс-тесты. Некоторые фирмы выпускают бумажные тес­ты для определения скрытой крови в фекалиях, которые основаны на пробе с гвояколовой смолой.

Клиническое значение. Кровь в кале обнаруживают при язвенной болезни, язвенно-эрозивном гастрите, гемостатическом илиусе (тромбоэмболические колики), эймериозе и некоторых других болезнях.

Обнаружение стеркобилина (пробы Шлезингера). Комочек кала растирают приблизительно с 10-кратным объемом дистиллирован­ной воды, приливают равное количество реактива Шлезингера (10 г цинка ацетата, растворенного в 90 мл 96%-ного этилового спирта) и несколько капель раствора Люголя (йода 1 часть, калия йода 2, воды 17 частей), фильтруют. Фильтрат дает зеленую флуо­ресценцию, которая лучше видна на черном фоне. Образцы кала защищают от действия света.

Клиническое значение. При заболеваниях печени, меха­ническом препятствии оттоку желчи в кишечник отмечают сниже­ние или полное отсутствие стеркобилина в кале. Усиленное жел­чеотделение или повышенный распад эритроцитов ведет к увели­чению стеркобилина в кале. В первом случае реакция отрицатель­ная, во втором — положительная.

Имеются пробы, позволяющие обнаружить и определить стер-кобилиноген, аммиак, растворимую слизь в кале, клетки кишечно­го эпителия, злокачественных опухолей, нейтрального жира, рас­тительной клетчатки, крахмала, соединительной ткани, мышечных волокон (см. Клиническая лабораторная аналитика / Под ред. В. В. Меньшикова. Том III. — М.: Лабпросс, 2000. — 384 с).

Московская государственная академия тонкой химической тех­нологии им. М. В. Ломоносова (ООО «Борис-99», Москва, Малая Пироговская, 1) производит и реализует наборы реактивов для ⁴ комплексного химико-микроскопического исследования крови, мочи, кала, мокроты, желудочного сока и спинномозговой жидкос­ти. Набор для общего анализа кала позволяет определять скрытую кровь, стеркобилин, билирубин, степень гидролиза крахмала, на­личие мышечных и эластических волокон, цист простейших, жир­ных кислот и др.

4.4. ИССЛЕДОВАНИЕ МОКРОТЫ

Мокрота — патологическое отделение органов дыхания, выбра­сываемое при кашле. В состав ее могут входить слизь, экссудат, клетки крови, элементы распада тканей, микроорганизмы, яйца гельминтов, мицелий грибов и др.

Мокроту извлекают из трахеи с помощью специальных носо-трахеальных зондов (Габрилавичуса, Корикова и др.) или из горта­

ни после рефлекторно вызванного кашля. У лошадей образец мок­роты берут через резиновую трубку, введенную в трахею.

Физические свойства. Слизистая мокрота слегка беловатая, вяз­кая, характерна для острого бронхита; серозная — жидкая, бес­цветная, пенистая, наблюдается при гиперемии и отеке легких; слизисто-гнойная — желтого или зеленоватого цвета, вязкая, обра­зуется при хронической бронхопневмонии; серозно-фибринозная — характерна для крупозной пневмонии; гнойная — появляется при гнойно-катаральной пневмонии, прорыве абсцесса, зеленовато-жел­того оттенка. Красный цвет мокроты обусловлен наличием в ней крови.

Запах у мокроты чаще отсутствует. Зловонный запах появляется при гангрене, абсцессе легких, аспирационной бронхопневмонии. В мокроте можно обнаружить кусочки омертвевшей легочной ткани при гангрене легких, частицы опухолей, сгустки фибрина, которые присутствуют при дифтерийном ларингите, крупозной пневмонии.

Микроскопия. Микроскопическое исследование мокроты про­водят в нативных и окрашенных препаратах. Материал для иссле­дования выбирают из разных мест и переносят металлической иг­лой на предметное стекло, покрывают покровным стеклом так, чтобы мокрота не вытекала за его края. Препарат должен быть тон­ким, элементы в нем должны располагаться однослойно. Про­смотр вначале проводят под малым увеличением (объектив х 8, окуляр х 10), при котором обнаруживают скопление клеток, нити эластических волокон, элементы новообразований, затем под большим увеличением (объектив х 40, окуляр х До).

Исследование под большим увеличением позволяет обнаружить в значительном количестве лейкоциты (воспалительные, нагнои-тельные процессы), эритроциты в виде желтоватых дисков (легоч­ное кровотечение, застой в малом круге кровообращения), микро­организмы.

Цилиндрический мерцательный эпителий в небольшом коли­честве присутствует в каждом образце мокроты, в большом — при трахеите, бронхите, бронхопневмонии.

В эпителиальных клетках специальными методами исследова­ния находят вирусные тельца-включения — хламид и и (хламидиоз-ная бронхопневмония) или микоплазмы (микоплазменная пнев­мония).

Альвеолярные макрофаги — крупные клетки, в 2—3 раза боль­ше лейкоцитов, в большом количестве появляются в мокроте при воспалении бронхов и легких, застое крови в малом круге крово­обращения, пороках сердца. Цитоплазма их содержит различные включения: бесцветные (миелиновые) зерна, желто-коричневые от гемосидерина и др.

Макрофаги можно выявить реакцией образования берлинской лазури. Кусочек мокроты помещают на предметное стекло, при­бавляют 1—2 капли 2%-ного раствора кислоты хлористоводород­ной и 1—2 капли 5%-ного раствора желтой кровяной соли. Пере­мешивают стеклянной палочкой и покрывают покровным стек­лом. Излишек реактива удаляют фильтровальной бумагой. Через несколько минут зерна гемосидерина, находящиеся в макрофагах, окрашиваются в синий или сине-зеленый цвет.

В мокроте при распаде легочной ткани обнаруживают эласти­ческие волокна. Они имеют вид тонких двухконтурных изогнутых волоконец. Их обнаруживают не в каждой капле мокроты, поэтому прибегают к концентрации:

метод 1: к нескольким миллилитрам мокроты прибавляют такое же количество 10%-ного раствора натрия гидроксида и нагревают до растворения слизи. При этом растворяются слизь, форменные элементы крови, но остаются эластические волокна. Затем к жид­кости добавляют 3—5 капель 1 %-ного спиртового раствора эозина, центрифугируют, а осадок исследуют под микроскопом. Эласти­ческие волокна сохраняют свою структуру и выделяются яр­ко-красным цветом. Однако посторонние волокна и нити тоже могут окраситься эозином и мешать распознаванию эластических волокон;

метод 2: наиболее специфической пробой является окраска эластических волокон резорцин-фуксином Вейгерта. Готовят рас­твор красителя: 0,5 г основного фуксина и 1 г резорцина растворя­ют в 50 мл дистиллированной воды, нагревают до кипения и пос­тепенно приливают раствор из 2 г железа хлорида в 10 мл воды. Смесь кипятят 5 мин, осторожно встряхивая, после охлаждения фильтруют. Фильтр с осадком переносят в колбу, заливают 70 мл 96%-ного этилового спирта и осторожно нагревают. Осадок краски при этом должен раствориться. После удаления фильтра к охлаж­денному раствору добавляют 1 мл 25%-ной кислоты хлористоводо­родной. Хранят краситель несколько месяцев.

Ход определения. Препарат мокроты фиксируют в 96%-ном этиловом спирте в течение 2 мин, сливают спирт, поме­щают в бюксу с раствором красителя. После окраски препарат ополаскивают водой и выдерживают 2 мин в 96%-ном этиловом спирте, высушивают и микроскопируют под малым увеличением. Эластические волокна окрашиваются в красно-фиолетовый цвет; видны древовидные, ветвящиеся волокна, их обрывки.

В нативных неокрашенных препаратах мокроты можно обнару­жить мицелии, характерные для грибов различных видов, поселя­ющихся в органах дыхания (кандидоз, аспергиллез и др.), а также актиномицеты. Грибы из рода Кандида развиваются в органах ды­хания при длительном лечении животных антибиотиками. При по­ражении легких грибами из рода Кандида в нативном препарате обнаруживают почкующиеся дрожжеподобные клетки и ветвистый мицелий, на котором споры расположены мутовками. Друзы акти-номицетов макроскопически имеют вид мелких желтоватых зер­нышек, содержащихся в гнойной части мокроты. Микроскопичес­ки они представляют собой сплетения тонкого мицелия, концы которого заканчиваются колбообразными вздутиями. При окраске препарата по Граму нити мицелия грамположительны, колбооб-разные вздутия — грамотрицательны.

Окраска по Граму. Готовят реактивы: карболовый раствор ген-цианового фиолетового: 1 г генцианового фиолетового растворяют в 10 мл 96%-ного этилового спирта, раствор выливают в 100 мл 1—2%-ного раствора карболовой кислоты, взбалтывают; раствор Люголя — 1 г йода, 2 г калия йодида и 300 мл дистиллированной воды; йод и калия йодид растворяют сначала в 5—8 мл воды, а за­тем приливают оставшуюся воду; 96%-ный этиловый спирт; 10%-ный раствор карболового фуксина: 10 г карболового фуксина и 90 мл дистиллированной воды.

На фиксированный препарат кладут полоску фильтровальной бумаги и смачивают ее раствором генцианового фиолетового. Кра­сят 1,5—2 мин. Бумагу сбрасывают и заливают раствором Люголя на 2 мин, препарат прополаскивают в спирту до серого цвета. Про­мывают водой и окрашивают 10%-ным раствором карболового фуксина 10—15 с. После этого препарат опять промывают водой, высушивают и исследуют под микроскопом.

При окрашивании раздавленной друзы актиномицетов мице­лий приобретает фиолетовую, а колбочки розовую окраску. Акти-номицеты обнаруживают в мокроте при актиномикозе легких.

Бактериоскопия окрашенных препаратов. Для бактериоскопи-ческого исследования мазки готовят, растирая комочек мокроты между двумя предметными стеклами. Высушенный мазок фикси­руют, медленно проводя его 3 раза через слабое пламя газовой го­релки, и окрашивают чаще по Граму. В окрашенных по Граму пре­паратах обнаруживают грамположительные пневмококки, стрепто­кокки, грамотрицательные диплобациллы, Е. coli и др. Грамполо-жительная и грамотрицательная микрофлора — постоянный обитатель респираторных органов, она становится патогенной при определенных условиях. При воспалительных процессах в бронхах и легких ее количество резко возрастает. Специальными бактери­ологическими методами определяют вирулентность микрофлоры мокроты, ее устойчивость к антимикробным препаратам.

Источники: 28, 31.

4.5. ИССЛЕДОВАНИЕ ЛИКВОРА

Ликвор (спинномозговая жидкость) секретируется сосудистыми сплетениями центральной нервной системы и циркулирует в спе­циальных резервуарах или цистернах в области основания мозга, омывая извилины головного мозга, выпуклую поверхность мозга, центральный канал и подпаутиновое пространство спинного моз­га. Образование ликвора происходит в боковых желудочках мозга, а также в субарахноидальных пространствах. Вода и электролиты быстро проникают в цереброспинальную жидкость и также быстро уходят из нее. Ликвор выполняет функцию «подушки» для мозга, предотвращая или уменьшая его смещение. Метаболическая роль его не выяснена. Поэтому исследование ликвора проводят в основ­ном в целях диагностики воспалительных заболеваний ЦНС.

Получают ликвор люмбальной, субокципитальной и постокци-питальной пункциями, которые проводят специальными иглами с мандреном. Для лабораторных исследований берут 5—15 мл лик-вора; для подсчета клеток достаточно 0,5 мл. В ликвор, содержа­щий фибриноген, что бывает при менингите, добавляют антикоа­гулянт (ЭДТА). Операцию по получению ликвора проводят под наркозом с соблюдением правил асептики и антисептики.

Люмбальную пункцию проводят в месте между последним пояс­ничным позвонком и передним краем крестцовой кости; у собак — между 5-м и 6-м или 6-м и 7-м позвонками.

Субокципитальную пункцию делают в месте крыловидного от­верстия (в затылочной ямке) — между затылочной костью и атлан­том (первый шейный позвонок).

Постокципитальную (цервикальную) пункцию делают между атлантом и вторым шейным позвонком (эпистрофеем); у собак — между наружным затылочным выступом и краниовентральной час­тью остистого отростка эпистрофея.

Физические свойства. Ликвор представляет собой прозрачную жидкость, похожую на воду. Относительная плотность его у здоро­вых животных 1,004—1,008 кг/л, она повышается при менингите, менингоэнцефалите, энцефаломиелите, злокачественной ката­ральной горячке, уремии и диабете.

Ц в е т. У здоровых животных ликвор бесцветный, при пункции первые порции могут содержать кровь и быть окрашены в красный цвет. Ярко-красный цвет ликвора обусловлен наличием в нем кро­ви (эритрохромия) при кровоизлиянии вследствие травмы позво­ночника или черепа. Желтый (ксантохромия) и буровато-коричне­вый цвет придают ликвору продукты распада гемоглобина. Это бы­вает при застое крови в сосудах мозга, что приводит к поступле­нию плазмы в ликвор (застойная ксантохромия) или попадания в ликворное пространство крови. Эритрохромия и ксантохромия бывают при травмах, гиперемии и отеке мозга, солнечном ударе, гипертермии, пироплазмозе, нутталиозе, желтухе. Зеленоватую ок­раску ликвору может придавать биливирдин — продукт распада билирубина.

Прозрачность. В норме спинномозговая жидкость прозрач­ная. Помутнение ликвора происходит при наличии в нем гноя, большого количества белка, лейкоцитов, микроорганизмов, фиб­риногена (воспаление головного и спинного мозга и их оболочек).

Биохимические и морфологические исследования. В ликворе мож­но определить содержание общего белка, глобулинов, глюкозы, электролитов, клеток крови и других показателей.

Определение белка. В качестве унифицированного используют метод с кислотой сульфосалициловой и натрия сульфатом.

Принцип. Кислота сульфосалициловая вызывает коагуляцию белков и помутнение ликвора, степень которого пропорциональна содержанию белков.

Реактивы: 6%-ный раствор кислоты сульфосалициловой; 14%-ный раствор безводного натрия сульфата. Для анализа применяют свежеприготовленный рабочий раствор: смесь равных объемов приведенных выше реактивов;

1%-ный стандартный раствор альбумина. 1 г лиофилизирован-ного альбумина (из человеческой или бычьей сыворотки) раство­ряют в небольшом количестве 0,9%-ного раствора натрия хлорида в мерной колбе на 100 мл и доводят объем этим же раствором до метки. Реактив нестойкий, для стабилизации к нему добавляют 1 мл 5%-ного раствора натрия азида (NaN03). 1 мл раствора содер­жит 10 мг альбумина. В холодильнике можно хранить до 2 мес.

Ход определения. В пробирку вносят 5 мл свежеприготов­ленного рабочего раствора и 0,5 мл ликвора, перемешивают. Через 10 мин интенсивность помутнения измеряют на ФЭКе в кювете с длиной оптического пути 1 см против холостой пробы (0,9%-ного раствора натрия хлорида). Длина волны 410—480 нм (сине-фиоле­товый светофильтр). Расчет ведут по калибровочному графику.

Для построения калибровочного графика из калибровочного раствора готовят разведения и обрабатывают их как опытную про­бу. В 5 пробирок вносят соответственно 0,05, 0,1, 0,2, 0,5 и 1 мл раствора альбумина и в каждую из них доливают до объема 10 мл 0,9%-ного раствора натрия хлорида. Концентрация белка в этих растворах составляет соответственно 0,05, 0,1, 0,2, 0,5 и 1 г/л. Примечания. 1. Если муть начинает оседать, то перед измерени­ем интенсивности пробирку тщательно встряхива­ют. 2. Перед определением белка рекомендуется поставить качественную пробу Панди, и если ре­зультат реакции оценивается 3+ или 4+ (много белка), то ликвор разводят 0,9%-ным раствором натрия хлорида и при расчете учитывают степень разведения. 3. Прямолинейная зависимость ка­либровочной кривой сохраняется до 1 г/л. При бо­лее высокой концентрации белка в ликворе ее раз­водят 0,9%-ным раствором натрия хлорида. Клиническое значение. Концентрация общего белка в ликворе повышается при нарушении гемодинамики, воспалитель­ных процессах в головном и спинном мозге и их оболочках. В лик­воре, также как в сыворотке крови, общий белок представлен аль­буминами и глобулинами.

Определение глобулинов по реакции Панди. Принцип. Реак­ция основана на осаждении глобулинов насыщенным раствором карболовой кислоты.

Реактив: насыщенный раствор карболовой кислоты. 100 г карболовой кислоты растворяют в 1 л воды, встряхивают и поме­щают в термостате при 37 "С на 6—8 ч. Затем оставляют стоять 7 дней при комнатной температуре, надосадочную жидкость сли­вают и используют в качестве реактива.

Ход определения. На часовое стекло, помещенное на чер­ную бумагу, наносят 1 мл реактива и по краю наслаивают 1—2 кап­ли ликвора. В случае положительного результата в месте соприкос­новения реактива с ликвором образуется молочно-белое облачко, переходящее в муть.

Результаты реакции Панди обозначают четырьмя плюсами: сла­бая опалесценция 1+, заметная опалесценция 2+, умеренное по­мутнение 3+, значительное помутнение 4+.

Микроскопия. Микроскопию ликвора проводят в целях опреде­ления количества лейкоцитов, эритроцитов, дифференцировки клеточных элементов. Подсчет клеток в камере проводят в течение 1 ч после получения ликвора.

Подсчет лейкоцитов. Принцип. Количество лейкоцитов под­считывают в счетной камере после разрушения эритроцитов рас­твором уксусной кислоты.

Реактивы: 10%-ный раствор уксусной кислоты, подкрашен­ной метиленовым фиолетовым: ледяной уксусной кислоты 5 мл, воды до 50 мл, метиленового фиолетового 0,1 мл.

Оборудование: микроскоп с осветителем; камера Фук­са—Розенталя или с сеткой Горяева; смесители для подсчета лейко­цитов (меланжеры).

Ход определения. В меланжер набирают до метки I 10%-ный раствор уксусной кислоты, подкрашенный метиленовым фиолетовым; затем до метки II набирают ликвор. После встряхи­вания заполняют камеру Фукса—Розентеля содержимым меланже­ра, предварительно выпустив первую каплю. Камера Фукса—Ро-зентеля состоит из 16 больших квадратов, каждый из которых раз­делен на 16 малых — всего 256 квадратов. Глубина камеры 0,2 мм, общий объем 3,2 мкл.

Лейкоциты считают во всех 256 квадратах и полученное число делят на 3,2 (объем камеры). Результат соответствует количеству форменных элементов в 1 мкл ликвора; кроме того, полученный результат делят на 10/11 (степень разведения ликвора). Таким об­разом, формула для пересчета выглядит так:

Л-11 ₌ А 3,2 - 10 3'

где А — число форменных элементов в объеме 256 квадратов.

Для дифференциации лейкоцитов ликвор вначале центрифуги­руют, затем из осадка делает мазок, фиксируют и окрашивают.

Окраска по Розиной. Спинномозговую жидкость центрифугиру­ют 7—10 мин. Надосадок сливают, осадок помещают на обезжи­ренное стекло, легким покачиванием распределяют его по поверх­ности стекла, через 1—2 мин стекло ставят в вертикальное поло­жение, жидкость стекает. В зависимости от предполагаемого коли­чества лейкоцитов осадок располагают на стекле на участке от 1 до 3 см² и более. При очень большом количестве клеточных элемен­тов и наличии крови осадок распределяют по всей поверхности предметного стекла и тотчас сливают. При этом достигается мини­мальная толщина мазка.

Мазки высушивают в сушильном шкафу при температуре 40—50 "С. Затем фиксируют метанолом 1—2 мин и красят по Ро­мановскому: тонкий препарат с небольшим цитозом 6—7 мин, с большим цитозом и кровью 10—12 мин. Затем краску сливают, мазок промывают дистиллированной водой и высушивают. Если ядра имеют бледно-голубой цвет, мазок докрашивают еще 2—3 мин. Готовый мазок просматривают под микроскопом.

Кроме лейкоцитов в ликворе обнаруживают плазматические клетки, макрофаги, нейтрофилы, эозинофилы, опухолевые клетки и др.

Клиническое значение. Количество лейкоцитов в спин­номозговой жидкости здоровых животных не превышает 5—8 в 1 мкл. На лимфоциты приходится 60—80 %, на моноциты 20—40 %. Увеличение количества лейкоцитов (плеоцитоз) встречается при менингите, энцефалите, миелите, менингоэнцефалите различной этиологии. Резко повышается их содержание при опухолях ЦНС, хронических воспалительных процессах в оболочках мозга, а также в послеоперационном периоде.

Источники: 28, 31.

Для общего клинического анализа спинномозговой жидкости (определение белка с сульфасалициловой кислотой, глобулинов в реакции Панди, цитоза с реактивом Самсона) ООО «Борис-99» (Москва) производит и реализует набор реактивов.