Количество мкг рибофлавина в 1 мл стандарта- (л - л)

х = ; ■ — • 100.

Количество мл крови ■ (Р₂ - )

Второй вариант. Вытяжку и калибровочный рабочий раствор рибофлавина вносят в две одинаковые пробирки или кюветы и из­меряют интенсивность их флуоресценции посредством флуори-метра по шкале гальванометра. В обе пробирки прибавляют на кончике шпателя NaHCC^ и NaHS2C>4 (примерно по 0,1 г) для га­шения флуоресценции рибофлавина и снова измеряют флуорес­ценцию.

Расчет содержания рибофлавина ведут по формуле

(»-£)■ 20-УУ₂ ВлУ!

где х — содержание рибофлавина, мкг%; А — показания флуориметра для испытуемого раствора (первый отсчет); Б — показания флуориметра для испытуемого раствора после погашения (второй отсчет); В — показания флуориметра для калибровочного раствора, содержащего 20 мкг в 1 мл; 20 — содержание рибофлавина в 1 мл калибровочного рабочего раствора, мкг; л — количество крови, мл; V — общее разведение, мл; К[ — фильтрат, взятый на окисление, мл; — фильтрат после окисления, мл.

Источники: 8, 75.

* В величины Pi и Ру вводят поправки на разведение, т. е. умножают на соответствующее разведение.

Клиническое значение. Источник рибофлавина — корма, кроме того, он синтезируется бактериями преджелудков и кишечника. Бактериальный синтез рибофлавина наиболее выра­жен у жвачных животных, поэтому при рациональном их кормле­нии они не испытывают недостатка этого витамина. В слизистой оболочке кишечника, в печени и других тканях рибофлавин при участии АТФ фосфорилируется и превращается в активные соеди­нения — коферменты флавин-мононуклеоитид (ФМН) и фла-вин-адениннуклеотид (ФАД). Оба они участвуют в окислитель­но-восстановительных процессах в составе дегидрогеназ и оксидаз. ФМН служит коферментом дегидрогеназ, которые катализируют окислительное дезаминирование некоторых аминокислот и других

веществ. ФАД является коферментом дегидрогеназ р-окисления жирных кислот, сукцинаддегидрогеназы, ксантинкиназы и других ферментов.

У здоровых животных в крови 8—15 мкг%, в печени 39,6— 46,6 мкг/г общего рибофлавина. Снижение содержания рибо­флавина в крови и печени отмечается при недостаточном его пос­туплении с кормом, даче животным внутрь антибиотиков, амина­зина, обладающих антивитаминным действием и подавляющих бактериальный синтез. При гиповитаминозе В₂ уровень рибофла­вина в крови телят составляет 6 мкг% и ниже.

Определение токоферолов в плазме крови с а,а'-дипиридилом (2, 2'-дипиридил). Принцип. Метод основан на окислении то­коферолов хлорным железом и определении образовавшегося Fe в виде окрашенного комплекса с гх,гх'-дипиридилом, обладающим максимумом поглощения при 520 нм. Поправка на каротиноиды вносится по поглощению при 460 нм. Эфиры токоферолов при их определении гидролизуют КОН в присутствии аскорбиновой кис­лоты. Свободный токоферол определяют без окисления.

Реактивы: абсолютный этиловый спирт, перегнанный над таблетками калия гидроксида (КОН) и кристаллами калия перман-ганата (КМп0₄). Очистка от альдегидов: этиловый спирт перего­няют над таблетками КОН и кристаллами КМп0₄, выбрасывая первую и последнюю фракции (до 10 % общего объема);

концентрированный раствор калия гидроксида (КОН) — 50 г КОН в 50 мл дистиллированной воды;

10%-ный раствор кислоты аскорбиновой в дистиллированной воде. Готовят непосредственно перед опытом и нейтрализуют не­сколькими каплями концентрированной КОН;

0,3%-ный раствор ос,а'-дипиридила в н-пропиловом спирте. Со­храняют в склянке из темного стекла;

ксилол очищенный (х. ч.). Препарат встряхивают в делительной воронке с 3—4 порциями концентрированной серной кислоты (H₂S0₄), пока кислотный слой не перестанет окрашиваться, про­мывают водой, насыщенным раствором перманганата калия, вновь водой до удаления окраски КМп0₄, сушат над безводным Na₂S0₄ и перегоняют, отбрасывая первые и последние 10 % отгона;

0,12%-ный раствор FeCl3 • 6Н₂0 в абсолютном этиловом спир­те. Сохраняют в темной склянке;

0,Ь-ос-токоферол, калибровочный раствор в абсолютном спир­те этиловом концентрацией 100 мкг/мл.

Оборудование: фотоэлектроколориметр или спектрофо­тометр; пробирки 18 х 1,5 см с притертыми пробками; пробирки центрифужные; центрифуга.

Ход определения свободного токоферола. К 2 мл плазмы (сыворотки) крови приливают 1 мл дистиллирован­ной воды и 3 мл абсолютного этилового спирта, добавляемого по каплям при перемешивании. Доливают 5 мл ксилола, закрывают пробкой, интенсивно перемешивают 6 мин и центрифугируют 5—10 мин при 3000 мин . Отбирают 3 мл ксилолового экстракта, измеряют его оптическую плотность при длине волны 460 нм (поп­равка на каротины) против воды, прибавляют 1 мл раствора ос,а'-ди-пиридила в н-пропиловом спирте, перемешивают, добавляют 1 мл раствора FeCi3 • 6Н2О, тщательно перемешивают и точно через 2 мин фотометрируют при длине волны 520 нм против воды. Од­новременно таким же образом обрабатывают контроль на реакти­вы, содержащий вместо плазмы (сыворотки) крови 2 мл воды. Для определения содержания токоферолов рассчитывают оптическую плотность токоферолов по формуле

4>= Д520 -(Дк + 0,217)Д₄₆₍₎,

где D_e — оптическая плотность токоферолов; D^o — оптическая плотность опытной пробы при 520 нм; D_K — оптическая плотность контрольной пробы при 520 нм; 0,217 — экспериментально определенная поправка на оптическую плотность, обусловленную присутствием каротиноидов; Ддо — оптическая плотность опытной пробы при 460 нм.

Концентрацию свободного токоферола рассчитывают по калиб­ровочной кривой, для построения которой используют калибро­вочный раствор 0,Ь-ос-токоферола при содержании последнего от 10 до 100 мкг в пробе.

Ход определения суммарного токоферола и его эфиров. В пробирках 18 х 1,5 см с притертыми пробками смешивают 2 мл плазмы (сыворотки) крови, 1 мл 10%-ного раство­ра аскорбиновой кислоты, 0,2 мл концентрированной КОН и 3 мл абсолютного спирта. Вносят в пробирки шарики или осколки кварцевого стекла, накрывают их небольшими воронками и поме­щают на 10 мин в кипящую водяную баню так, чтобы пробирки были углублены в воду на 2 см. Верхнюю часть пробирок охлажда­ют током воздуха из воздуходува. Через 10 мин пробирки охлажда­ют холодной водой, добавляют 5 мл ксилола, интенсивно переме­шивают 8 мин, центрифугируют 5—10 мин при 3000 мин и далее обрабатывают, как описано выше.

Содержание эфиров токоферола рассчитывают по разности между количеством суммарного и свободного токоферола. По дан­ным ряда авторов, содержание свободного токоферола в плазме крови в 6—6,5 раза больше эфиров.

Примечания. 1. Желательно работать в затемненном помеще­нии и проводить фотометрирование через строго определенное время после добавления дипириди-ла, так как окраска нестабильна. 2. Сыворотку (плазму) крови можно хранить при комнатной температуре в течение 1 сут, при 5 °С 2 нед и при минус 20 °С 2 мес. Источник: 75.

Определение токоферолов в тканях и сыворотке крови методом колоночной хроматографии. Принцип метода общий для хрома­тографии. Наиболее удачный адсорбент для удаления примесей — оксид алюминия.

Реактивы: 96%-ный этиловый спирт;

абсолютный этиловый спирт; чистый бензол (без тиофена);

концентрированная серная кислота (H2SO4);

безводный натрия сульфат;

оксид алюминия для хроматографии, сильно активированный; петролейный эфир; углекислота или азот;

0,2%-ный раствор железа хлорного (РеС1з)в абсолютном спирте;

0,5%-ный раствор а,а'-дипиридила в абсолютном спирте;

стандартный раствор токоферола (250 мг 0,Ь-а-токоферола растворяют в мерной колбе ледяной уксусной кислотой до объема 250 мл).

Оборудование: адсорбционная колонка; фотоэлектро-колориметр; колбы; пипетки; пробирки; бюхтеревская воронка; делительная воронка; песочная баня.

Очистка алюминия оксида. 400 г алюминия оксида, используе­мого в качестве адсорбента, суспензируют в 200 мл концентриро­ванной H2SO4, в которой до этого было растворено 20 г цинка хло­рида. Добавляют 20 мл дистиллированной воды и ставят колбу в холодильник на 72 ч. Подготовленный таким образом алюминия оксид переносят в бюхтеровскую воронку, промывают обычной водой до нейтральной реакции, затем ацетоном и сушат на воздухе. Отвешивают необходимое количество приготовленного адсорбента и прокаливают его в муфельной печи при температуре 450 "С в те­чение 6 ч. Перед употреблением влажность алюминия оксида до­водят дистиллированной водой до 9 %.

Адсорбционная колонка. Хроматографию проводят в стеклянной трубке диаметром 10 мм, заполненной адсорбентом на высоту 80 мм. Рыхлость слоя должна быть такой, чтобы он пропускал 30 капель за 1 мин. Для предотвращения увлажнения адсорбента сверху насыпают безводный натрия сульфат. Перед началом хро­матографии через колонку пропускают чистый петролейный эфир (5—6 мл), регулируя скорость капания.

Ход определения. 2 мл сыворотки (плазмы) крови вно­сят в сухую делительную воронку (50 мл), прибавляют 10 мл этило­вого спирта, смесь энергично встряхивают 3 мин, после чего дваж­ды экстрагируют 10 мл бензола при встряхивании по 3 мин. Объ­единенный безбелковый экстракт со следами спирта высушивают над безводным натрия сульфатом в защищенном от света месте.

Навеску ткани (1—3 г) гомогенизируют с 20 мл спиртово-бен-зольной смеси (1 : 1), переносят в круглодонную колбу, закрывают пробкой и экстрагируют в течение 30—40 мин. После этого спир-тово-бензольный экстракт фильтруют в делительную воронку и омыляют свежеприготовленным 50%-ным раствором КОН (55 % объема омыляемого вещества). Так как токоферол очень чувстви­телен к воздействию щелочей и легко ими разрушается, процесс омыления проводят при полном отсутствии кислорода или под за­щитой антиокислителей. С этой целью в делительную воронку не­сколько раз вводят СО2 или высыпают 50—100 мг пирогаллола.

После окончания омыления в делительную воронку добавляют 50 мл дистиллированной воды с 1 мл концентрированной H2SO4 для нейтрализации КОН. Тщательно взбалтывают смесь и отделяют бен­зольную фракцию. Содержимое воронки промывают дистиллирован­ной водой до нейтральной реакции. Экстракт сушат в колбе над без­водным натрия сульфатом. Высушенный бензольный экстракт филь­труют в низком тигле, споласкивая осадок чистым бензолом, и выпаривают досуха на песочной бане при температуре 60 °С.

Хроматография. Неомыленный осадок растворяют в эфире трижды, используя по 5 мл его каждый раз, и наносят на подготов­ленную адсорбционную колонку. Каротиноиды вымывают петро-лейным эфиром. Токоферол экстрагируют 5—6 раз бензолом (по 1 мл). Элюат выпаривают в токе нейтрального газа, а сухой остаток растворяют в абсолютном спирте и доводят объем до 4,6 мл. До­бавляют 0,2 мл а,а'-дипиридила. Колориметрируют при 490 нм че­рез 2,5 мин после добавления FeCl3. Расчет ведут по калибро­вочному графику, построенному по стандартному раствору 0,Ь-а-токоферола.

Источники: 74, 75.

Клиническое значение. Богаты токоферолами рас­тительные масла, зародыши пшеницы, ячменя и других злаковых культур. Всасываются токоферолы в тонком кишечнике при нали­чии в корме жиров. Непосредственное участие в этом процессе при­нимают желчные кислоты. Основная функция токоферола — регу­ляция интенсивности свободных радикалов в клетках, ограничение скорости процессов перекисного окисления ненасыщенных жир­ных кислот в липидах биологических мембран. Благодаря токофе­ролу обеспечивается стабильность клеточных мембран. Токоферо­лы защищают витамин А от перекисного окисления, являются си-нергистами селена — тормозят перекисное окисление липидов. Селен как кофактор глутатионпероксидазы участвует в инактивиро-вании гидропероксидов липидов.

Недостаточность токоферола сопровождается усилением про­цессов перекисного окисления липидов, атрофией семенников и бесплодием, рассасыванием плода на ранних сроках беременнос­ти, мышечной дистрофией, некрозами печени и мозга и т. д.

В норме сыворотка крови здоровых животных содержит 0,6— 1,4 мг% (14—34 мкмоль/л) токоферолов. У новорожденных живот­ных их 0,3—0,5 мг% (7—12 мкмоль/л). Причина гиповитаминоза Е — недостаток в кормах токоферолов, плохое их усвоение вследствие за­болевания печени, желудка и кишечника. Уровень витамина Е в кро­ви также зависит от степени обеспеченности организма В-липопроте-идами, ответственными за транспорт токоферолов в организме.

Определение витамина С в плазме крови. Принцип. Аскор­биновая кислота (витамин С) восстанавливает трехвалентное железо в двухвалентное. Последнее образует с а,сс'-дипиридилом комплек­сное соединение розового цвета.

Реактивы: 5%-ный раствор трихлоруксусной кислоты (ТХУ). 5 г ТХУ растворяют в 95 мл дистиллированной воды;

40%-ный раствор ТХУ. 40 г ТХУ растворяют в 60 мл дистилли­рованной воды;

3%-ный раствор железа хлорного (FeC^). 1,5 г FeCl3 растворя­ют в 50 мл дистиллированной воды. Хранят не более 3 сут; *

1 %-ный раствор а,сс'-дипиридила. В воде а,сс'-дипиридил раство­ряется плохо, поэтому навеску его необходимо смочить 96%-ным этиловым спиртом. К 0,5 г а,сс'-дипиридила приливают 4 мл спирта, а затем в мерной колбе на 50 мл доливают дистиллированной во­дой до метки;

85%-ная фосфорная кислота (орто);

аскорбиновая кислота.

Оборудование: фотоэлектроколориметр; центрифуга; центрифужные пробирки; мерные колбы на 50 и 100 мл.

Ход определения. К 2 мл плазмы крови добавляют 0,3 мл охлажденного 40%-ного раствора ТХУ, перемешивают стек­лянной палочкой и оставляют на 10 мин на холоде (в воде со льдом) с целью более полной денатурации белков. Центрифугиру­ют 20 мин при 2000 мин^-1. К 1 мл надосадочной жидкости прибав­ляют 0,5 мл бидистиллированной воды, 0,1 мл 85%-ного раствора фосфорной кислоты (орто), 0,8 мл 1%-ного раствора а,сс'-дипири-дила и 0,1 мл 3%-ного раствора FeC^. Содержимое пробирки пос­ле добавления каждого реактива тщательно перемешивают и ос­тавляют на 30 мин для развития окраски. Окраска стабильна в те­чение 1 сут.

По истечении 30 мин пробы центрифугируют при 2000 мин^-1 и колориметрируют на ФЭКе при длине волны 525 нм (зеленый све­тофильтр) в кювете с толщиной слоя 5 мм против контрольной пробы (вместо надосадочной жидкости берут дистиллированную воду, а затем поступают так же, как с опытной пробой).

Расчет содержания витамина С ведут с помощью калибро­вочного графика. 33,3 г аскорбиновой кислоты растворяют в 100 мл 5%-ного раствора ТХУ. 10 мл этого раствора вносят в мерную колбу на 100 мл и доливают до метки 5%-ный раствор ТХУ. В 6 мерных колб на 100 мл вносят последовательно 4, 6, 8, 10, 20 и 30 мл стан­дартного раствора и доводят объем до метки дистиллированной во­дой. По 1,5 мл раствора из каждой колбочки вносят в центрифуж­ные пробирки, прибавляют по 0,1 мл 85%-ной фосфорной кисло­ты (орто), 0,8 мл 1%-ного раствора а,сс'-дипиридила и 0,1 мл 3%-ного раствора FeCl3, перемешивают, ставят на 30 мин для про­явления окраски.

Перед крлориметрированием пробы центрифугируют 5 мин при 2000 мин . Полученные результаты изображают графически на миллиметровой бумаге.

Примечания. 1. Стандартные растворы аскорбиновой кислоты нестойки. Их готовят непосредственно перед опре­делением. 2. Содержание витамина С в плазме кро­ви при ее хранении снижается. 3. Определять коли­чество витамина С необходимо в свежей плазме, отделенной от форменных элементов в течение 4 ч после отбора проб крови.

Источники: 44, 60.

Клиническое значение. Аскорбиновая кислота учас­твует в различных обменных реакциях: гидроксилирование проли-на при синтезе коллагена: превращение 3,4-диоксифенилэтилами-на в норадреналин; превращение кортикостероидов и трансферина и т. д. Всасывается она в желудочно-кишечном тракте, главным образом в тонком кишечнике. Уровень аскорбиновой кислоты в сыворотке крови животных колеблется в пределах 0,2—1,5 мг%. В плазме крови он несколько выше, чем в сыворотке. Снижение содержания в сыворотке крови до 0,3—0,4 мг% и ниже сопровож­дается клиническими симптомами гиповитаминоза.

Определение витамина В₁₂ в биологических жидкостях и тканях. Количественное определение витамина Bj₂ (кобаламин, цианкоба-ламин) в настоящее время проводится химическими и микробио­логическими методами. Наибольшей точностью и специфичнос­тью обладает микробиологический метод.

Принцип. Микробиологический метод количественного определения витамина Bj₂ с культурой Escherichia coli 113-3 осно­ван на определении интенсивности роста микроорганизмов путем измерения мутности их размножением. По данным интенсивности роста в исследуемом материале строится стандартная кривая, по которой находят искомое количество витамина.

Реактивы: 1) культура Escherichia coli 113-3. Ее выращива­ют на агаровых косяках и хранят в холодильнике. Раз в месяц куль­туру пересевают на свежую агаровую среду и после пересева вы­держивают 24 ч в термостате при 37 °С;

2) агаровая среда. Состав агаровой среды в расчете на 100 мл: а) казеиновый кислотный 10%-ный гидролизат — 6 мл; б) калия фосфат двузамещенный (К₂НР04) — 20 мг; в) железа сульфат (FeS0₄-7H₂0) - 0,5 мг. 100 мг FeS0₄-7H₂0 разводят в 100 мл дистиллированной воды, отсюда берут 0,5 мл; г) магния сульфат (MgS0₄ • 7Н₂0) — 20 мг. Указанные компоненты растворяют пос­ледовательно в одной порции воды; д) L-аспарагин — 20 мл (L-ac-парагин растворяют отдельно с прибавлением нескольких капель 1 н. раствора НС1 при слабом подогревании и затем прибавляют к вышеуказанному раствору. рН раствора доводят 1 н. раствором NaOH до 7,0. Затем добавляют); е) глицерин (10 г глицерина до­бавляют к 50 мл дистиллированной воды, отсюда берут 1 мл);

ж) агар-агар — 1,5 г; з) витамин В₁₂ (из ампулы, содержащей 100 мкг/мл, берут 0,1 мл) — 10 мкг; и) вода дистиллированная — 100 мл.

После подогревания на водяной бане до растворения агара вносят витамин Bi₂, смесь тщательно перемешивают, разливают в пробирки по 50 мл и стерилизуют в автоклаве 15 мин при 10⁵ Па (1 атм);

3) основная среда. Состав основной среды на 1 л: а) калий фос- форнокислый двузамещенный (К₂НРС>4) — 14 г; б) калий фосфор- нокислый однозамещенный (КН₂Р04) — 6 г; в) натрий лимоннокис- лый (СбН₅07№з • 5Н₂0) — 1 г; г) магний сернокислый (MgS0₄ х х 7Н₂0) — 0,2 г; д) аммоний сернокислый [(NH₄)₂SC>4] — 2 г; е) натрия хлорид (NaCl) — 1,0 г, ж) калия цианид (KCN) — 2 мг;

з) вода дистиллированная — до 1 л.

Указанные ингредиенты растворяют последовательно в дистил­лированной воде. Калия цианид добавляют в виде раствора, в 1 мл которого содержится 0,1—0,2 мг. Конечный рН среды должен быть в пределах 6,8—7,0. Во избежание потемнения при повторных сте­рилизациях растворы солей и глюкозы (4 г на 1 л дистиллирован­ной воды) готовят и стерилизуют отдельно кипячением в течение 30 мин. Непосредственно перед опытом оба раствора, т. е. основ­ную массу с калия цианидом и раствор глюкозы, смешивают в со­отношении 1:1;

4) агар;

5) ацетатный буфер. Готовят растворением в ацетате натрия тригидрата 13,61 г и 6 г 100%-ной уксусной кислоты в 1 л дистил- лированной воды;

6. 1 н. раствор NaOH;

7. 0,2 н. раствор NaOH;

8. 1 н. раствор НС1;

9. 0,2 н. раствор НС1;

10) толуол;

И) витамин Bi₂ в ампулах, применяемый для терапевтических целей;

12) дистиллированная вода.

Оборудование: термостат; сушильный шкаф; автоклав; аналитические весы; водяная баня; фарфоровые ступки и пестики; бюретки; мерные колбы на 100, 250 и 1000 мл; мерные цилиндры на 100 мл; воронки; стаканчики на 150—200 мл; пипетки; промыв­ная колба; беззольные фильтры; пробирки 20 х 160 мм; центри­фужные пробирки: марлево-ватные пробки; бактериальная петля.

Ход определения. Обработка содержимого рубца. Со­держимое рубца разводят дистиллированной водой в соотношении 1 :100. К 1 мл разведения, взятого в пробирку, добавляют 1 мл аце­татного буфера с рН 4,63 и доводят водным раствором калия ци­анида (концентрация 1,2 мг/л) до объема 20 мл. Пробирку закупо­ривают пробкой, перемешивают содержимое и помещают на 15 мин в кипящую баню. После остывания содержимое пробирки взбалтывают и фильтруют через сухой беззольный фильтр в сухую стерильную пробирку. Фильтрат должен быть совершенно про­зрачным. Его рН при помощи 1 н. раствора NaOH и 0,2 н. раствора НС1 доводят до 6,8—7,0. Этот фильтрат в случае необходимости может храниться в холодильнике в закрытой пробирке до 7 дней.

Обработка ткани печени. Ткань печени, замороженную в жид­ком кислороде или азоте, растирают в фарфоровой ступке. Берут навеску 100 мг и тщательно растирают с 0,5 мл ацетатного буфера и небольшим количеством вышеупомянутого раствора калия циа­нида, переносят в колбочку и доводят раствором последнего до 50 мл. Затем колбочки закрывают марлево-ватными пробками и по­мещают на 15 мин в кипящую водяную баню, дают остыть, филь­труют, разводят дистиллированной водой 1:10 000 и при помощи 1 н. раствора NaOH или 0,2 н. раствора НС1 доводят рН до 6,8—7,0.

Обработка ткани мышц. Ткань мышц, замороженную в жидком кислороде или азоте, растирают в фарфоровой ступке. Берут 200 мг ее и тщательно растирают с 1 мл ацетатного буфера и небольшим ко­личеством раствора калия цианида, переносят в колбочку и доводят этим раствором до 20 мл. Затем колбочку закрывают марлево-ватны­ми пробками и помещают на 15 мин в кипящую водяную баню, да­ют остыть, фильтруют и при помощи 1 н. раствора NaOH или 0,2 н. раствора НС1 доводят рН до 6,8—7,0.

Приготовление стандартного раствора витамина Bj2- Для полу­чения калибровочной кривой используют водный раствор витамина В)2, в 1 мл которого содержится 0,1 мкг витамина. Раствор хранят в холодильнике с притертой пробкой под слоем толуола. В день опыта делают дальнейшее разведение в 2000 раз до содержания 0,00005 мкг витамина В12 в 1 мл (50 пкг).

Постановка опыта включает приготовление стандартного ряда исследуемых и контрольных образцов.

Стандартный ряд. По стандартному ряду строится стандартная (калибровочная) кривая. Для стандартного ряда готовят 30 одина­ковых пробирок (размером 20 х 160 мм). В каждую пробирку на­ливают 5 мл основной среды и возрастающее количество раствора ви­тамина В₁₂ концентрации 50 пкг/мл, а именно 0, 0,5, 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 3,5; 4,0; 4,5 мл и дополняют дистиллированной водой до 10 мл. Пробирки с раствором закрывают марлево-ватными пробками и стерилизуют в кипящей водяной бане в течение 30 мин, дают ос­тыть и до посева сохраняют при комнатной температуре.

Исследуемые образцы. Для каждого исследуемого образца берут 6 пробирок (таких же, как для стандартного ряда). Затем в пробир­ки вносят по 5 мл основной среды и добавляют различные коли­чества исследуемого материала (экстракта) — 0,5; 1,0; 1,5 мл, а на каждую градацию берут две пробирки. Объем раствора во всех про­бирках доводят дистиллированной водой до 10 мл и стерилизуют, как стандартный ряд.

Контрольные образцы. 2 мл обработанного материала в пробирке смешивают с 2 мл 0,2 н. раствора NaOH и кипятят в водяной бане в течение 30 мин. После охлаждения доводят рН раствора до 6,8—7,0 при помощи 10—12 капель 0,2 н. раствора НС1 или 0,2 н. раствора NaOH и фильтруют через беззольный фильтр с последу­ющим промыванием дистиллированной водой. Фильтрат перели­вают в пробирку, содержащую 5 мл опытной среды, дополняют дистиллированной водой до 10 мл и стерилизуют, как и опытные образцы. Для каждого исследуемого материала готовят два таких образца.

Посев. В стандартный ряд исследуемые и контрольные образцы вносят по одной капле из одной и той же пипетки бактериальной взвеси, приготовленной следующим образом. Две центрифужные пробирки с 5 мл опытной среды и 5 мл стандартного раствора вита­мина В]2 (50 пкг/мл в каждой) стерилизуют в кипящей водяной ба­не в течение 30 мин и после охлаждения засевают Е. coli с твердой агаровой средой. Засеянные пробирки ставят в термостат при 37 "С на 20—24 ч. Затем бактериальную суспензию центрифугируют 15—20 мин при 4000 мин . Жидкость смывают, осадок промыва­ют, центрифугируя с физиологическим раствором NaCl. Осадок суспендируют в 2 мл физиологического раствора NaCl и получен­ную взвесь используют для посева. Все пробирки на 20—24 ч по­мещают в термостат при 37 °С.

Учет интенсивности роста Е. coli. По окончании инкубации со­держимое каждой пробирки взбалтывают и замеряют мутность на фотоэлектроколориметре (ФЭК-М) при синем светофильтре по шкале, показывающей процент пропускания света. По получен­ным данным строят калибровочную кривую. При построении стандартной кривой лучше не соединять все полученные точки, а провести плавную кривую между ними. По величине светопропус-кания трех параллельных пробирок (берут среднее арифметичес­кое) на оси абсцисс находят соответствующее количество витами­на в данной пробирке. Для этого откладывают на оси ординат среднее значение мутности для каждой точки стандартного раство­ра витамина В\2, содержащегося в данной пробирке. Затем, учиты­вая количество обработанного материала, высчитывают концент­рацию витамина В12 умножением на разведение. Из полученных величин берут среднюю, а из полученной средней вычитают полу­ченную в контрольном опыте.

Точность и воспроизводимость метода при прочих равных услови­ях в значительной степени зависят от применяемой культуры Е. coli, чувствительность которой к витамину В12 может значительно менять­ся в зависимости от условий культивирования — частоты пересева, качества твердой среды, температурного режима и других факторов.

Источники: 38, 56.

Клиническое значение. Витамин Bj₂ синтезируется микроорганизмами рубца и кишечника. Для синтеза цианкобала-мина используют микроэлемент кобальт. В тканях кобаламин об­разует коферментные формы: метилкобаламин и дезоксиаденозин-кобаламин, которые участвуют в реакциях образования метионина, превращения метилмалонил-КоА в сукцинил-КоА, в образовании коферментных форм фолацина, а следовательно, в синтезе ДНК и в пролиферации кроветворных клеток.

Недостаток кобаламина отмечается при дефиците протеина, ко­бальта, болезнях желудочно-кишечного тракта, сопровождаемых на­рушением микробиального синтеза витамина Bj₂. Гиповитаминоз Bj₂ характеризуется нормо- или гиперхромной мегалобластической анемией, плохим усвоением белка и как следствие этого исхуданием, снижением в крови, тканях, рубцовом содержимом концентрации кобаламина.

Содержание витамина В₁₂ в различных материалах (по данным Львовской государственной академии ветеринарной медицины)

Содержимое рубца жвачных животных 5—12 мкг%

Печень крупного рогатого скота 300—600 мкг/кг

Почки крупного рогатого скота 200—500 мкг/кг

Мышцы крупного рогатого скота 10—18 мкг/кг

Печень свиньи 60—84 мкг/кг

Кровь крупного рогатого скота 10—18 нг%

Кровь свиньи 5—14 нг%

При гиповитаминозе Bj₂ кобаламина в крови телят и поросят содержится менее 78 нмоль/л, в печени — менее 0,1 мкг/г; выде­ление метилмалоновой кислоты с мочой возрастает до 30 мкг/л (В. В. Яшин).