38. Приготовление стандартных растворов

№ про­бир­ки	Калибровоч­ный раствор калия нитра­та рабочий, мл	Вода дис­тиллиро­ванная, мл	Содер­жание NOJ, мг	№ про­бирки	Калибровоч­ный раствор калия нитра­та рабочий, мл	Вода дис­тиллиро­ванная, мл	Содер­жание N03" , мг
1	0,0	6,0	0,00	5	1,0	5,0	0,2
2	0,2	5,8	0,04	6	1,5	4,5	0,3
3	0,3	5,7	0,06	7	2,0	4,0	0,4
4	0,5	5,5	0,10	оо	3,0	2,0	0,6

В каждую из пробирок приливают по 2 мл 10%-ного раствора уксусной кислоты и вносят на кончике скальпеля (не более 30 мг) цинковую пыль с марганца сульфатом. Далее проводят все опера­ции так же, как описано для опытных проб.

Для построения калибровочной кривой определяют оптиче­скую плотность растворов в 8 пробирках так же, как при опреде­лении опытных проб.

Затем на оси абсцисс откладывают количество нитрат-ионов (мг), а на оси ординат — найденные значения оптической плот­ности растворов.

Расчет ведут по формуле

V.B-1000

где х — содержание нитратов (нитрат-ионов), мг/кг; К; — общий объем фильтрата, мл; В — содержание нитрат-ионов, найденное по калибровочной кривой, мг; 1000 — коэффициент для пересчета на 1 кг; V2 — объем фильтрата, взятый для анализа, мл; Н — масса навески анализируемого образца, г.

При необходимости пересчета в калия нитрат (мг/кг) найден­ное количество нитрат-ионов следует умножить на 1,6.

Для выражения нитратов в мг% (мг/100 мл) пользуются формулой

У_УВ-100

Обозначения те же, что указаны в предыдущей формуле; 100 — коэффициент для пересчета в проценты.

Пересчет результата на абсолютно сухое вещество проводят по формуле

г = * ЮР ¹ 100-»"

где X] — содержание N—NC% мг/кг сухого вещества; х — содержание N—NO3 в анализируемом материале, мг/кг; 100 — коэффициент для пересчета в проценты; W — влажность материала, %; 100 — W — сухое вещество анализируемого материала, %.

Если необходимо рассчитать содержание нитратного азота в процентах на абсолютно сухое вещество корма, пользуются фор­мулой

v - je- 100 „„„ х

^х1

(100- И0 ■ Ю 000 ' (100-ио-100'

где Xj — содержание N—NO3 в сухом веществе, %; х — содержание N—NO3 в анализируемом материале, мг/кг; 100 — коэффициент для пересчета в проценты; W — влажность анализируемого материала, %; (100 - W) — сухое вещество анализируемого материала.

Пример. В 1 кг зеленой массы кукурузы найдено 1000 мг нит­ратного азота. Влажность зеленой массы 75 %. В этом случае в 1 кг сухого вещества корма содержится

Ш^Ш = 4000 MrN-NO₃

или в % на сухое вещество

1000■ 100 25• 10 000

0,4 % N-NO3.

Эта методика дает возможность одновременно определить в од­ной и той же пробе как нитраты, так и нитриты.

Подготовка проб для анализа на нитраты и нитриты в обоих случаях аналогична применению водного извлечения или извлече­ния с помощью диализа. Из одного и того же фильтрата или диа­лизата отбирают соответствующую часть для анализа — на нитри­ты по 10 мл, а на нитраты по 6 мл.

Определение нитритов в кормах, крови и патологическом мате­риале с использованием реактива Грисса. Принцип. Метод осно­ван на извлечении нитритов из проб дистиллированной водой и взаимодействии их с сс-нафтиламином и сульфаниловой кислотой в кислой среде с образованием азосоединения розово-красного цвета.

Реактивы: сульфаниловая кислота (ч. д. а.);

ос-нафтиламин (1-нафтиламин, ч. д. а.);

уксусная кислота концентрированная (х. ч.);

натрия нитрат (NaN02, х. ч.);

реактив Грисса: а) 0,5 г сульфаниловой кислоты растворяют в 150 мл 12%-ного раствора уксусной кислоты; б) 0,1 г а-нафтила­мина растворяют при нагревании в 20 мл дистиллированной воды, фильтруют и смешивают со 150 мл 12%-ного раствора уксусной кислоты. Перед употреблением одну часть раствора «а» смешивают с равной по объему частью раствора «б». Растворы «а» и «б» хранят отдельно;

калибровочный раствор натрия нитрита основной. 0,15 г высу­шенного при температуре 70—80 "С NaN0₂ растворяют в 1 л дис­тиллированной воды. Раствор хранят в холодильнике, он устойчив в течение 1 мес. 1 мл этого раствора содержит 0,1 мг NfJT;

рабочий калибровочный раствор натрия нитрита. 25 мл калиб­ровочного раствора натрия нитрита основного переносят в мерную колбу на 500 мл и доводят объем до метки дистиллированной во­дой. Раствор_ должен быть свежеприготовленным. 1 мл содержит 0,005 мг N0₂. Этот раствор используют для построения калибро­вочной кривой.

Оборудование: фотоэлектроколориметр; химические про­бирки; пипетки на 1 и 10 мл; мерные колбы на 500 и 1000 мл; ко­нические колбы; химические стаканы; мешочки или пленка для диализа; цилиндры на 10, 50 и 100 мл.

Ход определения. Для исследования берут 10 г измельчен­ного растительного или животного материала, цельной крови (мо­лока). В качестве антикоагулянта крови используют 1%-ный рас­твор гепарина. Пробы растительного происхождения, образующие при извлечении нитритов неокрашенные растворы, переносят в конические колбы и заливают 50 мл дистиллированной воды. Нит­риты извлекают в течение 1 ч, часто встряхивая содержимое кол­бы. Затем раствор фильтруют, пробу еще раз смывают 30 мл дис­тиллированной воды, объединяют эту часть раствора с первой, пропуская через тот же фильтр. Доводят объем до 100 мл и берут 10 мл для анализа на нитриты.

Извлечение нитритов из проб крови, молока, патологического материала и кормов растительного происхождения проводят мето­дом диализа. Для этого измельченные пробы кормов, органов и тканей или пробы крови (молока) помещают в мешочки или плен­ку для диализа и погружают в сосуд с 50 мл дистиллированной во­ды на 2 ч. Затем диализат фильтруют в калиброванный сосуд, а ме­шочек с пробой еще раз погружают в 20 мл дистиллированной воды на 30 мин в тот же сосуд. Этот диализат, фильтруя, объединяют с первым, доводя объем фильтрата до 100 мл дистиллированной во­дой. 10 мл фильтрата отбирают в пробирку для анализа на нитриты.

В пробирку с 10 мл анализируемого фильтрата добавляют 0,5 мл реактива Грисса и через 15 мин определяют оптическую плотность анализируемого раствора на ФЭКе при длине волны 536 нм (зеле­ный светофильтр) в кювете с толщиной слоя 10 мм против дистил­лированной воды.

Р асчет ведут по калибровочной кривой. Для составления шкалы стандартов в 10 пробирок вносят рабочий калибровочный раствор натрия нитрита в количествах, указанных в таблице 39.

В каждую пробирку вносят по 0,5 мл реактива Грисса. Через 15 мин после развития окраски определяют оптическую плотность в первых семи пробирках. На оси абсцисс откладывают количество NO2 в мг, а на оси ординат — найденные значения оптической плотности растворов. Оптическую плотность определяют только при наличии прозрачного и бесцветного фильтратов. В противном случае возможно только визуальное определение (сравнение опыт­ной пробирки со стандартной шкалой).

Расчет ведут по формуле

У_УВ-1000 ^х у₂н '

где х — содержание нитритов (нитрит-ионов), мг/кг; Уу — общий объем фильтрата, мл; В — содержание нитрит-ионов, найденное по калибровочной кривой, мг; 1000 — коэффициент пересчета на 1 кг; V₂ — объем фильтрата, взятый для анализа, мл; Н— масса навески анализируемого образца, г.

При необходимости пересчета в натрия нитрит (мг/кг) найден­ное количество нитрит-ионов умножают на коэффициент 1,5.

Если необходимо величину выразить в мг%, то в приведенной формуле берут коэффициент не 1000, а 100.

Клиническое значение. При внесении в почву больших доз азотных удобрений (более 200—300 кг действующего вещества на 1 га) или ненормированного количества жидкого навоза соли азотной кислоты — нитраты не используются полностью растения­ми на синтез аминокислот и растительного белка и накапливаются в них в концентрациях, вредных для животных и человека.

В процессе использования растениями нитратов образуются промежуточные продукты — нитриты и аммиак, которые значи­тельно токсичнее исходного вещества — нитратов. Поступление в кровь нитритов и нитратов ведет к образованию метгемоглобина, кислородному голоданию, нарушению окислительно-восстанови­тельных процессов и обмена веществ. У жвачных животных нитра­ты в рубце распадаются до нитритов и аммиака с последующим ис­пользованием азота этих метаболитов для синтеза аминокислот и бактериального белка. При значительном поступлении с кормом нитратов образовавшиеся из них нитриты и аммиак не успевают использоваться микрофлорой рубца и всасываются в кровь, вызы­вая нарушение обмена веществ и токсикоз.

Для животных токсичной концентрацией нитратов в кормах считают 0,21—0,52 % сухого вещества корма.

Наибольшая концентрация нитратов бывает в корнеплодах, бахчевых культурах, зеленой массе кукурузы, ржи, пшенице, овсе, траве многолетних культурных пастбищ при внесении под эти культуры больших доз азотных минеральных удобрений или навоза.

Концентрация нитратов и нитритов в растениях снижается, не достигает токсичной при внесении азотных удобрений дробными дозами в 2—3 приема за сезон, а также при организации регуляр­ного полива.

По нашим данным, содержание нитратов и нитритов снижается в процессе провяливания и сушки трав, силосования зеленой мас­сы. В засушливые годы при нерегулярном поливе содержание нит­ритов и нитратов в растениях повышается. При поступлении в ор­ганизм животных больших доз нитратов и нитритов помимо рез­кого повышения содержания меттемоглобина отмечаются падение уровня гемоглобина до 70 г/л и ниже, повышение общего белка сыворотки крови до 89 г/л и более, положительная коллоидно-оса­дочная проба. У здоровых животных при умеренном поступлении с кормом нитратов в крови и молоке их не обнаруживают или на­ходят в следовых количествах. При развитии токсикоза содержа­ние нитратов в крови повышается и составляет 30—60 мг/л и бо­лее, их находят в определенном количестве в молоке. Максималь­но допустимые уровни нитратов и нитритов в кормах и воде приведены в таблице 40.

Ионометрический метод определения нитратного азота. Прин­цип. Метод основан на измерении активности нитрат-иона ионо-селективным электродом в солевой суспензии 1 %-ного раствора алюмокалиевых квасцов при соотношении пробы и раствора алю-мокалиевых квасцов 1:2,5 для почв, 1:100 для сухих растений и кормов, 1:4 для сырого растительного материала. Определение нитратного азота в почве возможно также и в фильтратах водной и 0,05%-ной K2SO4 вытяжках при соотношении пробы и экстракта 1:2,5.

Реактивы: калия нитрат (х. ч.);

1 %-ный раствор алюмокалиевых квасцов (ч. д. а.). 10 г алюмо­калиевых квасцов растворяют в дистиллированной воде и доводят объем до 1 л;

10%-ный раствор алюмокалиевых квасцов (ч. д. а.). 100 г вещес­тва растворяют дистиллированной водой в мерной колбе на 1 л;

п риэлектродный раствор (0,1 моль/л KNO3 + 0,005 моль/л КО). 10,11 г KNO3 и 0,37 г КС1 растворяют в воде в мерной колбе на 1 л;

0,1 моль/л калибровочный раствор калия нитрата (KNO3). 10,11 г калия нитрата перекристаллизованного, высушенного при темпера­туре 105 °С до постоянной массы, взвешивают с погрешностью не более 0,01 г, растворяют в 1%-ном растворе алюмокалиевых квас­цов в мерной колбе на 1 л и доводят объем этим же раствором до метки;

0,01 моль/л калибровочный раствор KNO3. В мерную колбу на 1 л помещают 100 мл 0,1 моль/л раствора KNO3 и доводят объем до метки 1%-ным раствором алюмокалиевых квасцов;

0,001 моль/л калибровочный раствор KNO3. Готовят десяти­кратным разведением 0,01 моль/л раствора KNO3 1%-ным раство­ром алюмокалиевых квасцов;

0,0001 моль/л калибровочный раствор KN0₃. Готовят десяти­кратным разведением 0,001 моль/л раствора KNO3 1%-ным рас­твором алюмокалиевых квасцов;

насыщенный раствор КС1. В 100 мл дистиллированной воды при температуре 40—45 °С растворяют максимально растворяющу­юся массу КС1 и охлаждают.

Калибровочные растворы и приэлектродный раствор хранят в холодильнике. Полученные растворы используют для калибровки прибора.

Оборудование: рН-метр (рН-340, рН-74, И-120, И-130 и др.) с погрешностью измерения +5 мВ (+0,05 PNO3); ионоселек-тивный измерительный электрод ЭИ-ИОз-01 или аналогичного образца; электрод сравнения — хлорсеребряный насыщенный электрод типа ЭВЛ-1МЗ; весы аналитические, погрешность взве­шивания не более 0,001 г; весы технические квадрантные, погреш­ность взвешивания не более 0,1 г; дозатор вместимостью 50 мл для добавления алюмокалиевых квасцов, погрешность дозирования не более 1 %; мешалка лабораторная для перемешивания образца с экстрагентом; гомогенизатор или фарфоровая ступка с пестиком и промытый прокаленный песок; мезгообразователь; мясорубка или пластмассовая терка (для измельчения корнеплодов и овощей); встряхиватель или ротатор Р-120, или блок экстрагирования; мель­ница для размола сухих образцов почв; мельница для размола су­хих проб растений.

Ход определения. Подготовка ионоселективного измери­тельного электрода ЭИ-NOj-OL Внутреннюю полость корпуса 2 раза промывают дистиллированной водой, а затем 2 раза при-электродным раствором (0,1 моль/л KNO3 + 0,005 моль/л КС1). После промывки в корпус электрода заливают пипеткой 1,5 мл приэлектродного раствора и ввинчивают хлорсеребряный индика­торный электрод. Новый электрод перед первым измерением вы­держивают в 0,1 моль/л растворе KNO3. В интервалах между ис­следованиями, если они не превышают 5 сут, измерительный элек­трод хранят в 1 -10 моль/л растворе KNO3. При длительных перерывах между исследованиями электрод хранят на воздухе (или в 0,001 моль/л растворе KNO3), а перед началом работы выдержи­вают в течение 1—2 ч в 0,1 моль/л растворе KNO3.

Подготовка сравнительного хлорсеребряного электрода типа ЭВЛ-1МЗ. После распаковки электрод промывают дистиллирован­ной водой, заливают насыщенным раствором КС1 температурой 20 "С. Закрывают отверстие для заливки пробкой и выдерживают электрод сначала в кипящей, а затем в воде комнатной температу­ры по 15 мин в 3 цикла, погружая электрод в воду на 60—70 мм. В интервалах между работой электрод хранят, надевая пластмассо­вый колпачок, заполненный дистиллированной водой, и закрывая отверстие для заливки раствора КС1 пробкой. Во время работы это отверстие должно быть открытым.

Работоспособность ионоселективного электрода зависит от его характеристики: если при измерении стандартных растворов раз­ность показателей между двумя растворами меньше 48—50 мВ, значит, электрод находится в нерабочем состоянии. Электрод име­ет линейную функцию в диапазоне 1,0—4,0 PNO3 с наклоном 54—56 + 3 мВ на единицу PNO3.

Подготовка проб растительной продукции к анализу. Экстракцию нитратов из растительного материала выполняют 1%-ным раство­ром алюмокалиевых квасцов при соотношении массы пробы к объему экстрагирующего раствора 1:100 для сухих образцов или 1:5 для влажных проб. Сырой травянистый материал измельчают ножницами, перемешивают, отбирают среднюю пробу массой 10 г, помещают в стакан гомогенизатора, приливают 50 мл 1 %-ного рас­твора алюмокалиевых квасцов и гомогенизируют 1 мин. Плоды, корнеплоды, ягоды перед анализом, если нужно, отмывают от зем­ли, осушают фильтровальной бумагой и измельчают на терке или мясорубке. Полученную массу перемешивают, отбирают для ана­лиза 10 г, заливают 50 мл 1 %-ного раствора алюмокалиевых квас­цов и взбалтывают 30 мин.

Растительный материал также можно высушить, а затем измель­чить на мельнице. Взять 0,5 г муки, поместить в колбу, залить 50 мл 1 %-ного раствора алюмокалиевых квасцов, встряхивать 5—7 с и ос­тавить на сутки для извлечения нитратов.

Подготовка проб воды. К 9 мл анализируемой воды добавляют 1 мл 10%-ного раствора алюмокалиевых квасцов. Объем воды и раствора алюмокалиевых квасцов можно увеличить соответственно в 2—5 раз, не меняя соотношения пробы воды и раствора квасцов (9:1). В полученном растворе измеряют активность иона нитрата.

Подобным образом готовят образцы крови и молока. Смесь кро­ви (молока) с раствором алюмокалиевых квасцов взбалтывают в течение 30 мин на встряхивателе или ротаре. В полученной суспен­зии измеряют активность иона нитрата. Концентрацию нитратов в крови преимущественно проводят с реактивом Грисса.

Активность иона нитрата в пробе можно измерять непосредс­твенно в pN0₃ или делать замеры в мВ. Концентрацию ионов N0₃ на ионометре измеряют, пользуясь инструкцией, прилагаемой к прибору. Как пример ниже приводится методика измерения кон­центрации ионов NO3 на ионометре И-120.1.

1. Перед началом исследований подготовленные к работе элек­троды подключают к задней панели преобразователя. Мембран­ный (измерительный) электрод подключают к гнезду «Изм.», а хлорсеребряный (вспомогательный) — к гнезду «Всп.».

2. Кнопку под словом «Анионы» и валентностью, равной 1, утапливают.

Преобразователь включают в сеть и прогревают 30 мин. В тече­ние этого времени тщательно промывают электроды, особенно из­мерительный, снаружи. Для этого погружают измерительную сис­тему (электрод сравнения должен быть ниже измерительного на 3—4 мм) в стаканчик с дистиллированной водой, меняя ее не ме­нее 3 раз.

3. Вынимают электроды из воды, осушают их полоской филь- тровальной бумаги и погружают в первый стандартный раствор с концентрацией 1 • 10⁴ М KNO3 (pN0₃ = 4). Стандартные раство- ры должны иметь ту же температуру, что и исследуемые. Для этого стандартные растворы извлекают из холодильника, если они были приготовлены заранее и хранились в нем, не менее чем за 3—4 ч до начала измерений. Если измерения планируют начать с утра, то растворы вынимают из холодильника в конце предыдущего рабо­чего дня.

4. После установления показаний нажимают кнопку рХ-КООР-ДИНАТА на лицевой панели и на цифровом табло преобразовате­ля ручкой рХ-КООРДИНАТА, размещенной на боковой стенке, устанавливают значение PNO3 первого раствора, равное 4.

5. Отпускают кнопку рХ-КООРДИНАТА и ручкой КАЛИБ­РОВКА, размещенной на боковой стенке, устанавливают на табло значение PNO3 этого раствора, равное 4.

6. После промывки и удаления воды погружают электроды во второй раствор с концентрацией 1 • 10² М KNO3. После установле­ния показаний ручкой ГРАДИЕНТ, %, размещенной на боковой стенке, устанавливают на цифровом табло значение PNO3 второго раствора, равное 2,05. Если выставить это значение не удается, то дополнительно используют органы ручной температурной компен­сации (ручка «ТЕМПЕРАТУРА, °С»), расположенные на боковой стенке (органы дополнительной настройки по крутизне). Это свя­зано с тем, что данная электродная система не имеет определен­ных координат изопотенциальной точки, поэтому температурная компенсация не производится.

7. Для проверки настройки ионометра нужно вернуться к пер­вому контрольному раствору и повторить настройку по пунктам 3—6 до достижения совпадения значений, после этого приступают к определению PNO3 исследуемых растворов.

Примечание. При настройке ионометра по пунктам 3—6 парал­лельно снимают отсчеты как в единицах PNO3, так и в мВ, нажимая клавишу «мВ» на лицевой сторо­не преобразователя. Отсчеты в мВ необходимы для вычисления крутизны электродной характе­ристики. Она должна составлять 56,5 + 3,0 мВ на одну единицу PNO3 при 25 °С. Следовательно, из­менение PNO3 с 4,0 до 2,05 (две единицы pN0₃) должны сопровождаться изменением показания прибора на 113 ± 6 мВ. Если тактическая крутизна электродной характеристики окажется ниже, то это свидетельствует о непригодности электрода и необходимости его замены новым.

Расчет содержания нитратов (NO3) в воздушно-сухих расти­тельных образцах ведут по формуле

lQ-^pN°3-62-1000 • И

где х — содержание нитратов, мг/кг; lO~^pN°³ — концентрация нитратов в исследуемой вытяжке, моль/дм³; 62 — молярная масса нитрат-иона, г; V — объем экстрагирующего раствора, см³; 1000 — коэффициент перевода дм³ в см³; 10⁶ — коэффициент пересчета результатов анализа в мг/кг; Н — масса навески анализируемого материала, г.

Принимая V= 50 см³, Н — 0,5 г и проведя соответствующие вы­числения, получим следующую формулу для расчета:

х= Ю-^рЫ°з -6200.

Программа для вычисления результатов на микрокалькулято­рах, имеющих функцию 10х, имеет вид

_PN0₃[7E3 Н [У>] И 6200 Н И

содержание NO3, мг/кг.

Расчеты по содержанию нитратов в траве, овощах и фруктах с естественной влажностью производят по формуле

10-^pNO'-62 10°(V₊5g)

1000 • н

где ш — массовая доля воды в анализируемом материале, %.

Принимая V= 50 см³, Н= 10 г и проведя соответствующие вы­числения, получим следующую формулу для расчета:

_х = ₁₀-pⁿ°3 .6200 • (50 + ^).

Программа для вычисления результатов на микрокалькулято­рах, имеющих функцию 10х, имеет вид

[+] 10 ЕЕ 50 1 = | F 1 ЗАЛ | _PN0₃ -

F 10^х 1 х I 6200 I х I F I ИП I = |

-»мг/кг.

Несколько менее точные результаты по содержанию нитратов в траве, овощах и фруктах можно получить, пользуясь таблицами для перевода значений рГЧОз в мг г<Юз/кг (приложения 11 и 12).

В литературе примерно в равной мере встречаются три способа выражения концентрации нитратов: в расчете на азот (N—NO3), на нитраты (NO3) и в перерасчете на NaNC^. Для сопоставления таких данных используют следующие коэффициенты:

N—NO3 в пересчете на NO3 — 4,43;

N—NO3 в пересчете на NaN03 — 6,07;

NO3 в пересчете на N—NO3 — 0,225;

NO3 в пересчете на NaNC>3 — 1,37;

NaNC>3 в пересчете на N—NO3 — 0,165;

NaNC>3 в пересчете на NO3 — 0,73.

Нитратный азот с помощью ионоселективного электрода мож­но определять, используя калибровочный график и снимая пока­зания в мВ. В этом случае нитратный электрод подключают к гнез­ду «Изм», а хлорсеребряный электрод — к гнезду «ВСП», нажима­ют клавишу «мВ», включают диапазон измерения рН = 1—4 и делают замеры ЭДС (мВ) в калибровочных и исследуемых раство­рах. По калибровочному раствору находят величину PNO3.

Источники: 29, 51, 66.

Для определения нитратов экспресс-методом предложены нит­ратомеры типа «CARDV» производства фирмы «HORJ ВА» (Япо­ния), «Нитрат-тест», «Анион-410Н», Анион-7011 (частное ком­мерческое предприятие «ССС», г. Одесса), комплект «Микон-2» (ООО «НикоАналитик», г. Москва). В комплект «Микон-2» вхо­дят, в частности, микропроцессорный ионометр «Экспорт-001» и ионоселективный электрод ЭЛИТ-02 (нитрат), которые позволяют значительно упростить процесс измерений и свести его к достаточ­но простым и наглядным процедурам.

Портативные нитратометры позволяют определять количество нитратов в растениях и воде без специальной подготовки проб к анализу. Некоторые из них имеют автономное питание.