8.9. Методы определения алкалоидов

Алкалоиды — группа органических веществ, вырабатываемых различными растениями, которые принято называть ядовитыми (белена, красавка, чемерица и др.), содержащие в своей молекуле азот и обладающие высокой физиологической активностью (ако­нитин, атропин, лупинин, никотин, анабазин). Некоторые из ал­калоидов обладают исключительно высокой токсичностью. Так, смертельная доза аконитина для животных при введении внутрь составляет 0,02—0,05 мг/кг (И. А. Гусынин, 1947). Отмечены слу­чаи отравлений крупного рогатого скота и лошадей при поедании сена с примесью чемерицы, содержащей алкалоиды протовератрин и йервин. Для диагностики отравлений исследуют на алкалоиды растительные корма, с которыми связана интоксикация животных. Для определения в кормах алкалоидов в основном используют ре­акции осаждения и колориметрии.

Принцип. Метод основан на экстракции алкалоидов из ще­лочной среды хлороформом и идентификации их посредством спе­цифических реакций с различными реагентами — Эрдмана, Ман-делина, Вагнера, Драгендорфа, растворами танина, пикриновой, серной и азотной кислот (Сметов с соавт., 1987).

Реактивы: алкалоиды аконитин, атропин, берберин, бруцин, колхицин, кураре, дигитамин, дигитоксин, морфин, никотин, фи-зостиомин, пикротоксин, соланин, стрихнин, вератрин и др.;

аммония ванадат мета (ч. д. а.);

висмута нитрат (ч. д. а.);

йод элементный (ч. д. а.);

калия гидроксид (ос. ч.);

калия йодид (х. ч.);

кислота азотная (х. ч.);

кислота серная (ос. ч.);

кислота хлористоводородная (х. ч.);

кислота пикриновая (ч. д. а.);

3%-ный раствор натрия гидроксида (х. ч.);

реактив I: концентрированная серная кислота;

реактив II: концентрированная азотная кислота;

реактив III (Эрдмана). К 20 мл концентрированной серной кис­лоты прибавляют азотную кислоту (10 капель кислоты на 100 мл дистиллированной воды);

реактив IV (Манделина). Свежеприготовленный раствор: 0,01 г аммония ванадата в 2 мл концентрированной серной кислоты;

реактив V (Вагнера). 5 г йода в 100 мл 10%-ного раствора калия йодида;

реактив VI: 5%-ный водный раствор танина;

реактив VII: 1%-ный водный раствор пикриновой кислоты;

реактив VIII (Драгендорфа). 8 г висмута нитрата растворяют в 20 мл азотной кислоты, полученный раствор вливают в концент­рированный раствор калия йодида (27,2 г соли в 20 мл воды), через сутки фильтруют, объем фильтрата доводят до 100 мл дистиллиро­ванной водой;

реактив тимолфталеиновый. В 5 мл дистиллированной воды рас­творяют 1,5 г калия гидроксида или 1,0 г натрия гидроксида. 0,3 мл приготовленного раствора щелочи смешивают с 14,7 мл свежепро-кипяченной дистиллированной воды, берут 0,1 г свежеперекрис-таллизованного из спирта тимолфталеина и растворяют в 15 мл этанола-ректификата. К полученному раствору тимолфталеина до­бавляют 5 мл раствора калия или натрия гидроксида. Реактив ок­рашен в интенсивно-синий цвет. В склянке с притертой пробкой хранят 3 мес;

танин (ч. д. а.);

тимолфталеин (тимолсульфофталеин), индикатор.

Оборудование: весы аналитические и технические; баня водяная; колбы конические различной вместимости и другая посу­да и оборудование.

Ход определения. Готовят экстракт для определения алка­лоидов (по Габовичу). Пробу массой 1 г тщательно измельчают и переносят в коническую колбу с притертой пробкой на 50 мл, при­ливают 3 мл 3%-ного раствора натрия гидроксида (для сена — 5 мл, для муки и комбикорма — 15 мл), энергично встряхивают 1 мин. Приливают 10 мл хлороформа (для сена — 15 мл, для отрубей и му­ки — 25 мл), закрывают пробкой и еще раз встряхивают 3 мин. После отстаивания хлороформ фильтруют через бумажный фильтр в колбу или фарфоровую чашку, содержащую 5 мл воды, подкис­ленную двумя каплями кислоты хлористоводородной. Хлороформ отгоняют на водяной бане, водный остаток фильтруют и исследуют на алкалоиды.

Для идентификации алкалоидов в несколько пробирок неболь­шой вместимости (по числу реактивов и проб) вносят по 1 мл ис­пытуемого подкисленного кислотой хлористоводородной раствора или же наносят по 1—2 капли раствора на часовые стекла. Затем добавляют равные объемы реактивов на алкалоиды и наблюдают за изменением окраски или образованием осадка на темном фоне. В присутствии алкалоидов в испытуемой жидкости появляются помутнение, взвесь. Может образоваться осадок, цвет которого за­висит от использованных реактивов. Ставят не менее 3—4 группо­вых реакций с разными реактивами.

При подкислении раствора, содержащего алкалоиды, серной кис­лотой и обработке реактивом VIII (Драгендорфа) образуются следу­ющие осадки: акониты (хромово-желтый), атропин (красно-жел­тый), колхицин, морфин (желто-красный), наркотин, никотин, бру-цин, физостигмин, стрихнин (светло-желтый, постепенно темнеет), вератрин (светло-желтый, постепенно темнеет и переходит в канаре-ечно-желтый).

Определение алкалоидов методом ТСХ (по В. М. Серову, В. А. Вол­ковой, 1979). Принцип. Метод основан на извлечении алкалои­дов из растительного материала в виде солей или оснований, их качественной идентификации посредством цветных реакций и последующим полуколичественном определении после разделения в тонком слое алюминия оксида.

Метод позволяет определять алкалоиды в количестве 2—50 мг/кг. Относительная ошибка определения около 30 %.

Реактивы: вышеперечисленные алкалоиды и их растворы в хлороформе концентрацией 5 мг/мл;

алюминия оксид для хроматографии II степени активности;

10%-ный раствор 25% (ч. д. а.) аммиака водного;

висмута нитрат основной (ч. д. а.);

динопиловый эфир фталевой кислоты (динопилфталат) для хроматографии (ч. д. а.); калия йодид (х. ч.); кислота винная (ч. д. а.);

5 и 10%-ный растворы кислоты серной (ос. ч.); 25%-ный раствор кислоты уксусной (х. ч.); кислота щавелевая (ч. д. а.);

подвижный растворитель для ТСХ: хлороформ-ацетон-дино-пилфталат (5:4: 1);

реактив I. Растворяют 16,5 г висмута нитрата в 500 мл 25%-ной уксусной кислоты, отдельно растворяют 80 г калия йодида в 200 мл дистиллированной воды, оба раствора смешивают (1:1) и выдержи­вают в склянке из темного стекла 1 мес. Для проявления алкалои­дов смешивают 20 мл готового раствора с 20 мл ледяной уксусной кислоты и 100 мл воды, предел обнаружения на бумаге — 3—5 мкг алкалоида;

реактив II. В 800 мл дистиллированной воды растворяют 200 г винной кислоты, затем 17 г висмута нитрата. Отдельно растворяют 160 г калия йодида в 400 мл воды. Оба раствора смешивают и хра­нят в склянке из темного стекла. Для проявления алкалоидов берут 10 мл основного раствора, вносят 50 мл воды и растворяют 10 г винной кислоты. Чувствительность реакции на бумаге — 1—3 мкг алкалоида.

Оборудование: бумага хроматографическая марки «М»; ка­мера для люминесцентного анализа или УФ-осветитель; мельница электрическая МРГ-1; сито 100 меш.; центрифуга со стаканами вместимостью 100 мл и более и другое оборудование, необходимое для проведения анализа с помощью ТСХ.

Ход определения. Экстракцию проводят двумя способа­ми: извлечение водой в виде солей и в форме оснований органи­ческими растворителями.

При экстракции в виде солей 100 г измельченной пробы кормов заливают водой в соотношении для сочных кормов 1 : 4, для сухих — 1:10. В склянку с материалом при постоянном помешивании добав­ляют 10%-ный раствор серной кислоты до рН 3. Затем склянку тщательно взбалтывают и ставят в водяную баню при температуре 40 °С на 2 ч при периодическом помешивании. Дальнейшее иссле­дование сочных кормов проводят сразу же после окончания нагре­вания, сухих объектов — через 24 ч после настаивания.

Водную вытяжку из растений фильтруют через бумажный фильтр в делительную воронку, промывают хлороформом порция­ми по 30 мл 2 раза путем легкого взбалтывания в течение 5 мин. Хлороформ отделяют и отбрасывают, а к очищенной водной фазе (желательно на холоде) добавляют раствор аммиака до рН 9. Под­щелоченную водную вытяжку переносят во вторую делительную воронку и алкалоиды экстрагируют хлороформом 3 раза по 50, 30 и 20 мл путем легкого взбалтывания в течение 5—7 мин. Хлоро­формные экстракты объединяют, фильтруют через бумажный фильтр, предварительно смоченный обезвоженным хлороформом, в выпарительную чашку и упаривают досуха в токе воздуха.

Экстракцию в виде оснований применяют только для сухих кормов и высушенных ядовитых растений. Для этого 100 г измель­ченной пробы смачивают 10%-ным раствором аммиака до слабого увлажнения, переносят в склянку, плотно закрывают и оставляют на 30 мин. По истечении этого срока массу заливают хлороформом в соотношении 1 : 8 и оставляют при комнатной температуре на

24 ч. Экстракт фильтруют через бумажный фильтр в делительную воронку и трижды реэкстрагируют 5%-ным водным раствором сер­ной кислоты порциями по 50, 30 и 20 мл. Экстракты объединяют, фильтруют через ватный фильтр, вносят 10%-ный раствор аммиака до рН 9 и вновь извлекают хлороформом, промывая порциями по 30 мл. Хлороформные экстракты объединяют, фильтруют через бу­мажный фильтр в чашку для упаривания и упаривают досуха в токе воздуха.

Для идентификации алкалоидов сухой остаток одной пробы растворяют в 1 мл хлороформа. Часть полученного раствора нано­сят на Хроматографическую бумагу размером 3 х 7 см микропипет­кой. Затем реактивом I и II проявляют бумагу с нанесенными на нее пробами. При анализе алкалоидов в хлороформных экстра­ктах на бумаге появляются красные или малиновые пятна. В слу­чае появления нечетких пятен проявленную бумагу отмывают во­дой до обесцвечивания фона, при этом на белой поверхности бу­маги четко видны пятна алкалоидов красного цвета. В случае получения положительной реакции на алкалоиды их определяют методом ТСХ.

З атем начинают хроматографирование. На старт хроматографи-ческой пластинки микропипеткой или микрошприцем наносят 20 мкл хлороформных экстрактов. Для контроля рядом наносят стандартные растворы алкалоидов или же экстракты из отобран­ных ядовитых растений. Пластинку помещают в камеру для хрома-тографирования, используя в качестве подвижной фазы смесь хло­роформа, ацетона и линопилового эфира фталевой кислоты. Затем пластинку подсушивают и опрыскивают проявляющими реактива­ми I и II. Алкалоиды проявляются в виде пятен красного или ма­линового цвета на желтом фоне. Идентификацию алкалоидов, вы­деленных из кормов, проводят, сравнивая величины Rf пробы и стандартов. Величины Rf некоторых алкалоидов и окраска пятен приведены в таблице 59.

Клиническое значение. Обнаружение алкалоидов в кор­мах дает основание лишь на постановку предварительного диагно­за на отравление. Окончательный диагноз может быть поставлен при обнаружении в кормах остатков ядовитых растений — проду­центов данного вида алкалоидов, клиники интоксикации и данных патологоанатомического вскрытия павших животных.