2. Приготовление индикаторов

Окраска
кислотной формы	щелочной формы
Розовая Красная	Оранже­во-желтая Желтая
»	Синяя
Бесцветная	Красная
Желтая	»
Бесцветная	Синяя

Индикатор	Область перехода (интервал рН)
Метиловый	3,1-4,4
оранжевый,
0,1%-ный рас-
твор
Метиловый	4,4-6,2
красный,
0,1%-ный рас-
твор
Лакмус	5,0-8,0
(азолитмин),
0,5%-ный рас-
твор
Фенолфталеин,	8,0-10,0
0,1%-ный рас-
твор
Феноловый	6,8-8,0
красный,
0,1%-ный рас-
твор
Тимол фталеин,	9,3-10,5
0,5%-ный рас-
твор
Универсальный	2,0-10,0
индикатор (по
Кольтгофу)*

в 100 мл воды

0,1 г индикатора раство­ряют

в 100 мл этилового спир­та

0,5 г индикатора раство­ряют

в 100 мл воды

0,1 г индикатора раство­ряют

в 100 мл этилового спир­та

0,1 г индикатора раство­ряют в 100 мл 25%-ного водного раствора этило­вого спирта

0,5 г индикатора раство­ряют

в 100 мл этилового спир­та

Смешивают 0,1%-ные спиртовые растворы инди­каторов: диметиламиноа-зобензол 15 мл, бромтимол синий 20 мл, метиловый красный 20 мл, фенолфта­леин 20 мл, тимол фталеин 20 мл

* Универсальный индикатор имеет окраски: при рН 2 (и меньше) — красно-ро­зовую, рН 3 — красно-оранжевую, рН 4 — оранжевую, рН 5 — желто-оранжевую, рН 6 — лимонно-желтую, рН 7 — желто-зеленую, рН 8 — зеленую, рН 9 — си­не-зеленую, рН 10 (и выше) — фиолетовую.

Способы приготовления

2.5. ПРИГОТОВЛЕНИЕ БУФЕРНЫХ СМЕСЕЙ, КОЛОНОК, СИЛИКАГЕЛЬНЫХ ПЛАСТИНОК

Растворы большинства чистых химических веществ имеют неус­тойчивый рН, который изменяется при добавлении кислот и щело­чей. Многие биохимические анализы требуют выполнения реакций в условиях определенного интервала рН, мало изменяющегося при внесении небольших количеств кислоты или щелочи. Для этой цели применяют буферные растворы, представляющие собой смеси сла­бых кислот с солями этих кислот или смеси слабых оснований с со­лями слабых оснований. Буферным действием могут обладать смеси кислых солей разной основности, например NaH₂P04 + Na₂HP04, где первая соль играет роль слабой кислоты, а вторая — ее соли.

Способность раствора противостоять прибавлению кислоты или щелочи называется его буферной емкостью. Выражается она числом эквивалентных масс кислоты или щелочи, которые нужно прибавить к 1 мл раствора, чтобы его рН изменился на единицу. Для большинства буферных смесей интервал рН, в котором они обладают достаточным буферным действием, не превышает 2. Что­бы расширить этот интервал, пользуются буферными смесями, со­стоящими из нескольких слабых кислот и их солей, подобранных с таким расчетом, чтобы там, где кончается область буферного действия одной из них, начиналась область другой. Такие буфер­ные смеси называются универсальными.

Буферные растворы готовят согласно разработанным рецептам. Исходные растворы для буферных смесей приготавливают особен­но тщательно. Так, раствор NaOH не должен содержать соды. Для этого 100 г х. ч. NaOH растворяют в 120 мл воды и сливают в ци­линдр, плотно закрытый пробкой. В таком концентрированном растворе сода не растворяется и выпадает в осадок. Затем раствор осторожно декантируют и разводят до требуемой концентрации.

Буферные растворы готовят на дистиллированной воде, из ко­торой при кипячении (в течение 30—45 мин) удален С0₂, и хранят в сосудах с хлоркальциевой трубкой для предохранения от доступа С0₂ из воздуха.

Использование сефадекса в гель-фильтрации. В ветеринарных лабораториях широко используют методы хроматографии. Для разделения и фракционирования метаболитов получил распро­странение метод фильтрования растворов через гель, названный «сефадекс» (Швеция) — гель-фильтрация. Сефадекс имеет вид мелких зерен, набухающих в воде. Например, для разделения по­лисахаридов с различной молекулярной массой рекомендуют сле­дующие типы сефадекса.

Тип сефадекса

Молекулярная масса разделяемых полисахаридов

G—25, мелкий G—50, грубый

G-75 » G-100 »■ G-200 »

100-5000

500-10 000 1000-50 000 5000-100 000 5000-200 000

У белковых веществ диапазоны молекулярных масс шире, чем у полисахаридов.

Для использования сефадекса служит хроматографическая ко­лонка из боросиликатного стекла с рубашкой. Вначале сефадекс смешивают с водой, полученную смесь взмучивают, вливают в ко­лонку и дают осесть. Затем в колонку добавляют концентрирован­ный раствор исследуемого вещества так, чтобы не взмучивался верхний слой сефадекса. Равновесие устанавливается быстро, ско­рость вымывания значительно выше по сравнению с обычными ионитами. Фракции контролируют спектрофотометрически или по электропроводности.

Приготовление силикагеля и пластинок для метода тонкослойной хроматографии (ТСХ). Метод ТСХ имеет ряд преимуществ перед другими методами хроматографического анализа (колоночной хро­матографии и хроматографии на бумаге): вещества разделяются быстро — от нескольких минут до 2—3 ч; можно разделять малые количества вещества (0,1—0,05 мкг), а также выделять их препара­тивно (от 100 до 500 мг). Основан метод на сорбции растворенных веществ адсорбентом; при движении растворителя с разделяемой смесью веществ по неподвижной фазе — адсорбенту разделяемые компоненты перемещаются с различной скоростью в направлении движения растворителя. В качестве сорбентов применяют целлю­лозу, AI2O3, кизельгур и др. Наибольшее применение получил си-ликагель — соединение общей формулы Si02 • ИН2О.

Адсорбционные свойства силикагеля могут быть существенно изменены добавлением кислот, оснований, солей. Силикагель, пропитанный 100%-ным раствором сульфата аммония, использу­ют для разделения липидов и фосфолипидов, обработанный фос­фатным буфером — для разделения аминокислот. Силикагель, им-прегнированный нитратом серебра, позволяет разделить отдельные молекулярные типы фосфолипидов в зависимости от степени нена­сыщенности образующих их жирных кислот.

Для разделения липидов на отдельные фракции применяют марки силикагеля G, Н, DC, L, КСК гранулированный и др.

Подготовка силикагеля марки КСК. При отсутс­твии специально предназначенных для тонкослойной хроматогра­фии силикагелей рекомендуют продажный гранулированный или кусковой силикагель марки КСК или ШСК. Для этого кусковой силикагель измельчают на шаровой мельнице и пропускают с во­дой через сито. Через 30 мин воду удаляют декантацией, а осадок промывают сначала горячей водой, затем горячим этанолом, опять водой и концентрированной соляной кислотой до приобретения фильтратом светло-желтой окраски. Отмывают водой до отрица­тельной реакции на ионы хлора (помутнение 1—0,1%-ного раство­ра серебра нитрата). На ионы железа проверяют с роданидом аммо-нидом (калия, натрия). Отмытый силикагель сушат при 120—130 °С в течение 5—6 ч и просеивают через сита с размером ячеек 150—200 мкм. Хранят в банках с притертыми пробками.

Приготовление ТСХ-пластинок с закреплен­ным слоем сорбента. При отсутствии в лаборатории специ­ального аппликатора для нанесения слоя сорбента на хроматографи-ческие пластинки последние можно изготовить следующим образом. Просеянный через сито с отверстиями диаметром 150—200 мкм си-ликагель тщательно перемешивают с 6 % (по массе) чистого меди­цинского гипса или 1 % растворимого крахмала и наносят смесь на поверхность матированных с помощью наждачного порошка обез­жиренных стеклянных фотопластинок (13 х 18 см). Толщина слоя сорбента, образуемого на пластинке, обеспечивается при разрав­нивании его стеклянной трубкой (диаметром 1,5—2 см), на кото­рую на расстоянии 12 см друг от друга наматывают по нескольку витков проволоки диаметром 0,5 мм. Такие кольца служат ограни­чителями размера наносимого слоя, а также гарантируют его пос­тоянную толщину (0,5 мм). Пластинки с нанесенным слоем сор­бента размещают на строго горизонтальной поверхности и опрыс­кивают из пульверизатора дистиллированной водой до полного насыщения слоя. После подсушивания на воздухе (избегать пыли) пластинки помещают в сушильный шкаф и активируют при 105—110 "С в течение 1 ч или при 140 °С в течение 0,5 ч. Приго­товленные таким образом пластинки хранят в эксикаторах над поглотителем (кальция хлорид). При длительном хранении пласти­нок их активность следует периодически проверять.

Если пластинки готовят для экспресс-метода, сорбент можно наносить на пластинку в виде жидкой взвеси силикагеля с гипсом или крахмалом в воде с помощью пипетки. Более или менее одно­родные по свойствам пластинки получают при нанесении одина­ковых объемов такой взвеси на каждую пластинку. Отклонения от рекомендованных марок силикагелей и режимов их обработки до­пускаются в исключительных случаях.

2.6. ПРАВИЛА БЕЗОПАСНОСТИ ПРИ РАБОТЕ С РЕАКТИВАМИ, ПРАВИЛА ИХ ХРАНЕНИЯ

При работе в лаборатории особое внимание обращают на тех­нику безопасности. При несоблюдении элементарных правил ее при проведении лабораторных работ, незнании свойств материа­лов, с которыми приходится иметь дело, неумелом обращении с ре­активами и приборами могут происходить травмы. При работе не­обходимо придерживаться общих правил:

в лаборатории следует соблюдать чистоту и порядок; изучить по справочникам используемые в лаборатории вещества, обращая особое внимание на огнеопасность, ядовитость, возможность об­разования взрывчатых смесей с другими веществами;

анализы, связанные с применением концентрированных кислот и щелочей, а также с выделением вредных, ядовитых, огнеопасных газов, паров, с образованием мелких кусочков веществ, разбрызги­ванием жидкости, надо выполнять в вытяжном шкафу, а в некото­рых случаях — в защитных очках, фартуках и нарукавниках;

работу с легковоспламеняющимися и взрывоопасными вещест­вами (бензин, бензол, сероуглерод, ацетон, диэтиловый эфир и др.) проводить в вытяжном шкафу, вдали от огня и включенных нагре­вательных приборов (если нужно использовать водяную баню, то ее предварительно нагревают в другом месте, применяют также электроплитку со скрытыми нагревательными элементами); хра­нить их в толстостенных склянках, железных ящиках, выложенных асбестом; общий запас огнеопасных жидкостей в рабочем помеще­нии лаборатории не должен превышать 2—3 л;

концентрированные и ядовитые жидкости не набирать в пипет­ку ртом, а пользоваться резиновой грушей или пипеткой с балло­ном; при переливании их из больших бутылей в меньшие сосуды применять сифоны;

не бросать в раковину бумагу, твердые вещества, не выливать в нее остатки кислот, щелочей, огнеопасных и сильнопахнущих жид­костей; собирать их в специальные толстостенные, плотнозакры-вающиеся склянки;

не нагревать закупоренные сосуды и аппараты, кроме специаль­но для этого предназначенных;

соблюдать особую осторожность при работе со сжатыми газами (водородом, кислородом, хлором, метаном, ацетиленом, аммиаком и др.); предохранять баллоны от падения, ударов, толчков, нагре­вания; перекатывать баллоны осторожно, вручную, в наклонном положении;

при работе с вакуумом надевать защитные очки; при проведе­нии работ в вакууме не применять плоскодонных колб — они будут раздавлены;

все химические реактивы хранить только в соответствующей по­суде с этикетками и ясными надписями, а разлагающиеся на свету реактивы (AgN03 и др.) — в темной посуде;

соблюдать крайнюю осторожность при вскрытии склянок с ре­активами, остерегаться повреждения склянок; если притертая стеклянная пробка сидит плотно, то горлышко сосуда обертывают смоченным горячей водой полотенцем и осторожно постукивают по верхней части пробки деревянным предметом, извлекая ее; можно склянку перевернуть вверх дном и опустить горлышком в сосуд с водой или разбавленной соляной кислотой; стеклянные краны, которые «заедает», открывают теми же приемами или отма­чивают несколько часов в 5%-ном мыльном растворе.

Концентрированные растворы кислот и щелочей для постоян­ного пользования нужно держать в небольших бутылях и склянках вместимостью 1—2 л. Под такую посуду подкладывают кусок стек­ла или подставку из пластмассы, стойкой к кислотам и щелочам.

При разбавлении кислот, особенно серной и азотной, нужно добавлять кислоту к воде, иначе произойдет вскипание воды и разбрызгивание кислоты.

При переливании дымящих кислот, таких, как концентрирован­ная соляная или дымящая азотная, надевают противогаз, респира­тор или обвязывают рот и нос полотенцем, смоченным в растворе соды. Применение предохранительных очков при этом обязатель­но. Работу лучше проводить под тягой. Если кислота прольется на пол, ее тут же засыпают песком, собирают его и выносят из поме­щения. Облитое место обмывают раствором соды или аммиака.

Большие бутыли с кислотами и щелочами лучше хранить в сто­яках, тогда облегчается переливание из них и достигается ббльшая безопасность. Большие бутыли с кислотами, щелочами и другими агрессивными жидкостями хранят только в плетеных корзинах. Эти бутыли нельзя ставить прямо на пол, особенно каменный. На каждой бутыли должна быть этикетка: иногда к горлышку бу­тыли (или к корзине) прикрепляют фанерную дощечку с надписью о содержимом. Работу с большими бутылями (переноска, перели­вание и др.) нельзя выполнять одному.

Очень осторожного обращения требуют щелочи — гидроксиды натрия и калия, концентрированные растворы аммиака. Куски твердой щелочи нельзя брать руками, нужно надевать резиновые перчатки или пользоваться тигельными щипцами, которые после употребления тщательно обмывают. При разбавлении кусковой щелочи надевают резиновые перчатки и предохранительные очки. Взвешивают твердые щелочи в стеклянной или фарфоровой таре.

Растворение NaOH и КОН в воде вызывает сильное разогрева­ние, поэтому щелочи растворяют не в стеклянной посуде, а в фар­форовых стаканах или чашках. Сначала готовят концентрирован­ные растворы (32—40%-ные, плотностью 1,35—1,45 г/см ), дают им отстояться (иногда несколько дней), затем раствор с осадка ос­торожно при помощи сифона переливают в другую посуду.

Хранят растворы щелочей и твердые щелочи в хорошо закрытой посуде, бутыли со щелочами нельзя закрывать стеклянными при­тертыми пробками. Концентрированные растворы щелочей сильно выщелачивают стекло бутылей, поэтому внутреннюю часть бутыли рекомендуют покрыть парафином или смесью церезина и вазелина, или сплавом парафина с полиэтиленом. Для этого несколько кусков парафина помещают внутрь бутыли и нагревают ее в сушильном шкафу или над электрической плитой (осторожно) до 60—80 "С. Когда парафин расплавится, бутыль поворачивают и распределяют разогретую массу тонким слоем по всей внутренней поверхности.

Работа с концентрированным раствором аммиака требует боль­шого внимания и осторожности. Поступает он в лаборатории в ви­де 25%-ного водного раствора. Переливать его из крупных бутылей в мелкие нужно обязательно в противогазе, на открытом воздухе или под тягой.

2.7. ПОМОЩЬ ПРИ ОЖОГАХ И ОТРАВЛЕНИИ

При ожогах огнем делают длительную примочку раствором пер-манганата калия или этиловым спиртом, а затем обожженное мес­то покрывают специальной эмульсией. При ожогах кислотами ко­жи или глаз обожженное место промывают большим количеством воды, а затем разбавленным раствором гидрокарбоната натрия (ЫаНСОз). При ожогах едкими щелочами пораженное место хоро­шо обмывают проточной водой, затем 1%-ной уксусной кислотой; особенно опасны щелочи для роговицы глаза. При работе с твер­дыми щелочами обязательно надевают очки. Если на кожу попадет разъедающее органическое вещество, смывать водой его бесполез­но, нужно быстро промыть большим количеством органического растворителя (спиртом, бензолом); причем избегают образования на коже концентрированных растворов.

В случае отравления хлором или парами брома следует длитель­но вдыхать спирт, затем выйти на свежий воздух.

При сильных ранениях, ожогах и отравлениях после оказания первой помощи пострадавшего немедленно направляют в поли­клинику.

Медикаменты и перевязочные средства всегда должны нахо­диться в лабораторной аптечке. Растворы гидрокарбоната натрия, аммиака и уксусной кислоты нужно держать на каждом рабочем столе.

Источники: 13, 15, 22, 23, 43, 46, 58, 61, 62.