3.3.10. Методы определения микроэлементов

В целях оценки обеспеченности организма животных микроэле­ментами помимо анализа содержания их в кормах нередко прибега­ют к определению их количества в крови, молоке и других биологи­ческих субстратах.

Для определения марганца, цинка, железа и других микроэле­ментов используют химические, атомно-абсорбционные, поляро­графические и другие методы.

Определение кобальта в крови по методу С. И. Гусева в модифи­кации А. А. Титовой. Принцип. Метод основан на получении ок­рашенного комплекса кобальта с 2-(2-пиридилазо)-5-диэтилмета-аминофенолом (ПААФ) при рН 5, экстракции его хлороформом и измерении оптической плотности среды.

Для устранения влияния других микроэлементов, реагирующих с ПААФ, их окрашенные комплексы разрушают 5 моль/л раство­ром серной кислоты.

Реактивы: 20%-ный раствор натрия цитрата (х. ч.);

3 моль/л раствор натрия ацетата трехводного (х. ч.). 408 г соли растворяют в бидистиллированной воде и доводят объем до 1 л;

0,3 моль/л раствор соляной кислоты. В мерную колбу на 1 л вносят 24 мл концентрированной соляной кислоты (плотность 1,19) и доливают до метки бидистиллированной водой;

0,05%-ный раствор ПААФ. 50 мг реактива растворяют в 100 мл 96%-ного этилового спирта;

азотная кислота концентрированная (х. ч.);

5 моль/л раствор серной кислоты. 266,3 мл серной кислоты (плотность 1,84) доводят бидистиллированной водой до 1 л;

хлороформ;

калибровочный раствор кобальта основной. 0,4034 г кобальта хлорида (C0CI2 • 6Н2О, х. ч.) растворяют в бидистиллированной воде, добавляют 5 мл концентрированной соляной кислоты и до­водят объем бидистиллированной водой до 1 л. В 1 мл калибровоч­ного раствора содержится 100 мкг кобальта;

рабочий калибровочный раствор кобальта. 1 мл основного ка­либровочного раствора разводят до 100 мл 0,3 моль/л раствором со­ляной кислоты. В 1 мл раствора содержится 1 мкг кобальта;

20%-ный раствор соляной кислоты. 48,2 мл соляной кислоты (плотность 1,19) доводят до 100 мл бидистиллированной водой.

Оборудование: фотоэлектроколориметр; фарфоровые тигли или чашки; сушильный шкаф; весы аналитические; электроплитка; муфельная печь; водяная баня; бюретка на 25 мл; пипетки измери­тельные на 0,2, 1, 5 и 10 мл.

Ход определения. В фарфоровый тигель (или чашку) вно­сят 20 мл цельной крови, ставят на электроплитку и медленно обугливают. Далее озоляют в муфельной печи в течение 4 ч при температуре 500—550 °С. В теплый тигель приливают 2 мл 50%-ной азотной кислоты, тщательно перемешивают стеклянной палочкой, смывая приставшие к ней частицы бидистиллированной водой в тигель. Упаривают досуха на электроплитке или водяной бане, не допуская разбрызгивания содержимого. Тигель ставят в муфель­ную печь, доводят температуру до 500 °С и выдерживают в течение 1 ч. При наличии частичек угля обработку азотной кислотой пов­торяют. К золе приливают 2,5 мл 20%-ного раствора соляной кис­лоты и 5 мл бидистиллированной воды. Тигель накрывают часо­вым стеклом, ставят в водяную баню и кипятят 5 мин. Содержимое тигля фильтруют в мерную колбу на 25 мл. Тигель обмывают не­сколько раз бидистиллированной водой и объем доводят до метки.

В делительную воронку или пробирку с притертой пробкой на 45—50 мл вносят 10 мл раствора золы, 2,5 мл 20%-ного раствора натрия цитрата, 2,5 мл 3 моль/л раствора натрия ацетата, 1 мл рас­твора ПААФ. Тщательно перемешивают после прибавления каждого реактива. Через 10 мин приливают 10 мл 5 моль/л раствора серной кислоты, перемешивают, добавляют 5 мл хлороформа из бюретки и встряхивают в течение 1 мин. Дают слоям жидкости хорошо разде­литься, и нижний слой сливают в кювету с толщиной слоя в 1 см. При использовании пробирок с притертой пробкой нижний слой отбирают при помощи пипетки с грушей или отсасывают верхний слой при помощи водоструйного насоса. Фотометрируют при дли­не волны 570 нм в кювете с толщиной слоя 1 см против контроля.

Содержание кобальта вычисляют по калибровочному графику. В делительные воронки или пробирки с притертыми пробками вносят 0,2, 0,4, 0,8, 1,0, 1,5 и 2 мл рабочего калибровочного рас­твора кобальта. Объем доводят до 10 мл 0,3 моль/л соляной кисло­той. Далее поступают, как и с образцом. В контроль вместо раство­ра кобальта вносят 0,3 моль/л раствор соляной кислоты.

По результатам измерений строят калибровочную кривую.

Расчет ведут по формуле

А У-100

где х — количество кобальта, мкг%; А — количество кобальта, найденное по калибровочной кривой, мкг; V — объем раствора золы, мл; В — количество крови, мл; С — количество раствора золы, взятое на анализ, мл; 100 — коэффициент для пересчета в мкг.

Источники: 49, 52.

Клиническое значение. Кобальт — составная часть ви­тамина В12, который непосредственно участвует во многих обмен­ных процессах в организме, в частности, он необходим для нор­мального кроветворения (активирует синтез протопорфирина), участвует в синтезе метионина, в процессе переноса кислорода. Ко­бальт необходим для жизнедеятельности микрофлоры рубца. Он ак-тивирующе влияет на щелочную фосфатазу костной ткани. Поэто­му его недостаток приводит к нарушению гемопоэза, усвоения пи­тательных веществ корма, задержке роста и развития, снижению продуктивности и воспроизводительной функции, появлению ги-покобальтоза, остеодистрофии, анемии, стеатозу печени и другим болезням.

Содержание кобальта в крови колеблется от 2,5 до 5,0 мкг% (0,43—0,85 мкмоль/л), в плазме крови 0,5—0,7 мкг% (0,085— 0,12 мкмоль/л), в молоке 1—4 мкг% (0,17—0,68 мкмоль/л). Снижение уровня кобальта в крови отмечают при его недостаточном пос­туплении с кормом и водой, плохом усвоении вследствие рас­стройства деятельности желудочно-кишечного тракта. Низкий уровень кобальта наблюдается при гипокобальтозе, гиповитами­нозе Bj2, алиментарной и экзотической остеодистрофиях, уровс-кой болезни.

Определение йода, связанного с белком (СБЙ), в сыворотке кро­ви по Акланду в модификации С. В. Силаевой. Принцип. Иод в присутствии церия арсената образует окрашенное соединение, интенсивность которого измеряют на фотоэлектроколориметре.

Реактивы: 10%-ный раствор цинка сульфата. 10 г вещества растворяют в 90 мл дистиллированной воды;

0,5 моль/л раствор натрия гидроксида. 20 г натрия гидроксида вносят в мерную колбу на 1 л и доливают бидистиллированной во­дой до метки;

2 моль/л раствор натрия карбоната. 21,2 г натрия карбоната без­водного растворяют в мерной колбе на 100 мл и доводят до метки бидистиллированной водой;

2 моль/л раствор соляной кислоты. Фиксанал соляной кислоты разводят бидистиллированной водой в мерной колбе на 500 мл или берут 82 мл концентрированной соляной кислоты (плотность 1,19) и доводят бидистиллированной водой до 500 мл;

10%-ный раствор серной кислоты. К 94,5 мл дистиллированной воды приливают 5,5 мл концентрированной серной кислоты (плотность 1,84);

раствор мышьяковистого ангидрида. 3,8 г мышьяковистого ан­гидрида растворяют в 50 мл 1 моль/л раствора натрия гидроксида, добавляют 50 мл бидистиллированной воды и доводят объем до 500 мл 1,75 моль/л раствором серной кислоты. Ядовит. Хранят в темном месте в эксикаторе;

1,75 моль/л раствор серной кислоты. 97,7 мл концентрирован­ной серной кислоты (плотность 1,84) доводят до 1 л бидистилли­рованной водой;

калибровочный раствор йода. Раствор А готовят из фиксанала калия йода. В 1 мл 0,1 моль/л раствора калия йода содержится 12,68 мг йода. Раствор В: 2 мл раствора А доводят бидистиллиро­ванной водой до 1 л. В 1 мл раствора содержится 25,38 мкг йода. Раствор С: 0,4 мл раствора В доводят бидистиллированной водой до 500 мл. В 1 мл содержится 0,202 мкг йода. Раствор D: 10 мл рас­твора С доводят бидистиллированной водой до 100 мл. В 1 мл со­держится 0,02 мкг йода;

раствор церия сульфата. Берут 39 г аммоний-церий-сульфата и растворяют в 1 л 1,75 моль/л раствора серной кислоты;

1 моль/л раствор натрия гидроксида. 40 г натрия гидроксида в мерной колбе доводят бидистиллированной водой до 1 л.

Оборудование: фотоэлектроколориметр; кварцевые про­бирки центрифужные; ультратермостат или водяная баня, поддер­живающая температуру 37 °С; секундомер; муфельная печь.

Ход определения. В кварцевую центрифужную пробирку вносят 1 мл сыворотки крови, 7 мл бидистиллированной воды, 1 мл 10%-ного раствора цинка сульфата и 1 мл 0,5 моль/л раствора натрия гидроксида. После внесения каждого реактива тщательно перемешивают стеклянной палочкой. Через 30 мин центрифугиру­ют в течение 15 мин при 3000 мин . Надосадочную жидкость ос­торожно сливают. Осадок трижды промывают 10 мл бидистилли-рованной воды с последующим центрифугированием и удалением жидкости.

К осадку добавляют 1 мл 2 моль/л раствора натрия карбоната, перемешивают стеклянной палочкой. Осадок высушивают в су­шильном шкафу при температуре 100 °С в течение 10—12 ч, а затем сжигают в муфельной печи при температуре 400—450 °С. Пробир­ки охлаждают, к золе добавляют 1 мл 2 моль/л раствора соляной кислоты и 5 мл бидистиллированной воды. Перемешивают стек­лянной палочкой тщательно в течение 20—30 мин. Центрифугиру­ют в течение 10 мин при 3000 мин . В опытную пробирку вносят 3 мл центрифугата, 1 мл бидистиллированной воды, 0,5 мл раство­ра мышьяковистого ангидрида и 1 мл 3,5 н. (1,75 моль/л) раствора серной кислоты.

В контрольную пробу вносят 3,5 мл бидистиллированной воды, 0,5 мл 2 моль/л раствора соляной кислоты, 0,5 мл раствора мышь­яковистого ангидрида и 1 мл 1,75 моль/л раствора серной кислоты, сливают осторожно, обмывают ею стенки пробирок, перемешива­ют и ставят в ультратермостат или водяную баню при температуре 37 "С. Вместе с образцами в термостат помещают пробирку с рас­твором аммоний-церий-сульфата. Через 10 мин в каждую пробир­ку (не вынимая из термостата) с интервалом в 1 мин (по секундо­меру) вносят 0,5 мл раствора аммоний-церий-сульфата и переме­шивают. Фотометрируют через 12 мин (точно) на ФЭКе при синем светофильтре или на спектрофотометре при длине волны 434 нм в кювете с толщиной слоя 1 см против контроля, поочередно вы­нимая пробирки из термостата с интервалом в 1 мин.

Расчет результатов проводят по калибровочному графику. В 4 пробирки (№ 1, 2, 3, 4) вносят по 0,5 мл 2 моль/л раствора соляной кислоты. В пробирку № 1 добавляют 3,5 мл бидистиллированной воды, № 2 — 2,5 мл бидистиллированной воды и 1 мл калибровоч­ного раствора D (0,02 мкг йода), № 3 — 1,5 мл бидистиллирован­ной воды и 2 мл раствора D (0,04 мкг йода), № 4 — 0,5 мл бидис­тиллированной воды и 3 мл раствора D (0,06 мкг йода). Во все пробирки добавляют по 0,5 мл раствора мышьяковистого ангидри­да и по 1 мл 1,75 моль/л раствора серной кислоты. Затем все опе­рации выполняют так же, как с образцами.

Калибровочный график строят на полулогарифмической бума­ге. Величину экстинкции откладывают в логарифмическом, а ко­личество йода — в миллиметровом масштабах. Найденное по гра­фику количество йода в мкг умножают на коэффициент 200, чтобы получить мкг%.

Примечания. 1. В комнате, где проводят анализы, не должно быть следов йода. 2. Посуда и пробирки должны быть тщательно вымыты. 3. Все реактивы должны быть химически чистыми. 4. Используют только би-

дистиллированную воду, полученную с помощью стеклянного (на шлифах) перегонного аппарата. Источник: 52.

Клиническое значение. Тироксин и трийодтиронин об­разуются в фолликулярных клетках щитовидной железы из амино­кислоты тирозина и неорганического йода. Органический йод плаз­мы крови представлен в основном гормонами щитовидной железы, связанными с глобулинами и частично с альбуминами. Связанный с белком йод плазмы крови (СБЙ) на 90—95 % состоит из тирок­сина, поэтому его уровень в крови служит критерием для оценки функционального состояния щитовидной железы. Йод необходим для нормальной жизнедеятельности многих микроорганизмов же­лудочно-кишечного тракта.

У здоровых взрослых животных содержание СБЙ составляет 5—10 мкг% (394—788 нмоль/л), у телят первого дня жизни — 20,3, на третьи сутки — 12,2 мкг%.

При тиреотоксикозе в сыворотке крови содержится СБЙ выше 10 мкг%, при гипотиреозе — менее 3 мкг%. Снижение уровня СБЙ отмечается при кетозе коров, при недостаточном поступлении йо­да с кормом и водой, энзоотическом зобе (до 3 мкг% и ниже).

Определение марганца в крови перйодатным методом. Прин­цип. Калия метаперйодат в кислой среде способен окислять марга­нец (МПО4). Мешающие вещества (восстановители) удаляются или разрушаются в процессе обработки золы.

Реактивы: 1%-ный раствор калия метаперйодата (KIO4, х. ч.). 10 г вещества вносят в химический стакан, добавляют 400 мл бидис­тиллированной воды и 100 мл 85%-ной фосфорной кислоты (орто, х. ч.). Смесь подогревают до растворения калия метаперйодата, ох­лаждают, переносят в мерную колбу на 1 л, доводят до метки би­дистиллированной водой;

растворитель. В мерную колбу на 1 л вносят 100 мл концентри­рованной азотной кислоты (х. ч.), 50 мл 1%-ного раствора калия метаперйодата и доводят объем бидистиллированной водой до метки;

калибровочный раствор марганца основной. 0,4388 г перекрис­таллизованного марганца сульфата (х. ч.) растворяют в 1 л бидис­тиллированной воды. В 1 мл содержится 100 мкг марганца;

рабочий калибровочный раствор марганца. 10 мл основного ка­либровочного раствора доводят до метки в мерной колбе на 100 мл бидистиллированной водой. В 1 мл содержится 10 мкг марганца;

50%-ный раствор азотной кислоты;

10%-ный раствор азотной кислоты;

азотная кислота концентрированная (х. ч.).

Оборудование: тигли фарфоровые; весы аналитические; муфельная печь; электроплитка; фотоэлектроколориметр; пробир­ки из термостойкого стекла на 35—40 мл; водяная баня.

Ход определения. В фарфоровый тигель вносят 10 мл цельной крови и медленно обугливают на электроплитке. Тигель переносят в муфельную печь, доводят температуру до 500—550 °С и озоляют в течение 2 ч. Золу в тигле обрабатывают 2—3 раза 50%-ной азотной кислотой (2—3 мл идет на первую обработку и по 1—2 мл — на последующие). Содержимое тигля выпаривают на электроплитке. Далее обработку повторяют, добавляя 1 мл кисло­ты. Золу растворяют в 10 мл растворителя при подогревании и по­мешивании стеклянной палочкой. Фильтруют в пробирку с меткой на 25 мл. Фильтр предварительно увлажняют дистиллированной водой. Тигель ополаскивают 5 мл дистиллированной воды с после­дующим фильтрованием в эту же пробирку. К фильтрату добавля­ют 10 мл 1%-ного раствора калия метаперйодата и кипятят на во­дяной бане в течение 1 ч. Содержимое тигеля охлаждают и доводят объем бидистиллированной водой до 25 мл, перемешивают. Через 1 ч фотометрируют на ФЭКе при зеленом светофильтре (длина волны 540 нм) в кювете с толщиной слоя 10 мм против контроля (10 мл растворителя, 5 мл бидистиллированной воды, 10 мл рас­твора калия метаперйодата; смесь кипятят 1 ч).

Содержание марганца рассчитывают по калибровочной кривой. В пробирки, куда внесено по 10 мл растворителя, добавляют по 0,5, 1, 2, 3, 4 и 5 мл рабочего калибровочного раствора марганца. Объем доводят бидистиллированной водой до 15 мл, прибавляют 10 мл раствора калия метаперйодата. Пробы кипятят в течение 1 ч. Далее поступают так же, как с образцами. Содержание марганца в пробах составляет соответственно 5, 10, 20, 30, 40 и 50 мкг.

Расчет ведут по формуле

_{г =} А- 100 В '

где х — количество марганца в пробах, мкг%; А — количество марганца по калибровочной кривой, мкг; В — количество крови, мл; 100 — коэффициент пересчета в мкг%. Для перевода мкг% в мкмоль/л полученную величину умножают на 0,182.

Источники: 52, 65.

Клиническое значение. Действие марганца в организме разнообразное: является активатором щелочной фосфатазы, аргина­зы, пируваткарбоксилазы, оксалацитаткарбоксилазы и многих дру­гих ферментов, участвует в окислительно-восстановительных про­цессах, тканевом дыхании, костеобразовании. При его недостатке отмечаются задержка роста, остеодистрофия, нарушение репродук­тивной функции, расстройства нервной системы, у птицы — свое­образное заболевание — пероз (perosis — скользящий сустав).

В цельной крови и сыворотке марганца содержится примерно одинаково: у крупного рогатого скота 15—25 мкг/100 мл, у овец 5—10, у свиней 5—10 мкг/100 мл.

Определение цинка в крови с дитизоном по Н. А. Чеботаревой.

Принцип. Цинк с дитизоном образует комплексное соединение, дающее окраску, интенсивность которой зависит от концентрации элемента.

Реактивы: основной раствор дитизона (ч. д. а.). В делитель­ную воронку на 250 мл вносят 0,02 г дитизона и 100 мл четырех-хлористого углерода. Энергично встряхивают в течение 15 мин. Приливают 100 мл бидистиллированной воды, в которую предва­рительно вносят 0,5 мл 25%-ного раствора аммиака, встряхивают 2—3 мин. Удаляют слой четыреххлористого углерода. Промывают оставшийся оранжевый раствор дитизона 10 мл четыреххлористого углерода. Промывку повторяют 2 раза, сливая каждый раз четырех-хлористый углерод. В конце этой процедуры прибавляют 2,5 мл разведенной серной кислоты (1:5). Появляются черные хлопья. Перемешивают, добавляют 100 мл четыреххлористого углерода и встряхивают 1 мин. После разделения фаз раствор дитизона в че-тыреххлористом углероде сливают в чистую делительную воронку, добавляют 50 мл бидистиллированной воды и встряхивают в тече­ние 1 мин для удаления серной кислоты. Промывку водой повто­ряют еще 2 раза. Раствор дитизона переливают в сухую склянку темного стекла с притертой пробкой. Хранят в холодильнике до 1 мес. Качество реактива проверяют так: в делительную воронку вносят 5 мл раствора дитизона и 25 мл 0,01 н. раствора аммиака (0,7 мл 25%-ного раствора аммиака на 1 л дистиллированной воды), встряхивают 2—3 мин. Органический слой должен быть бесцвет­ным. Если он окрашен в бурый цвет, то раствор дитизона для ана­лиза не пригоден;

рабочий раствор дитизона. Готовят перед анализом. В сухую мерную колбу на 100 мл вносят 6 мл основного раствора дитизона и доводят объем до метки четыреххлористым углеродом. Хорошо перемешивают;

ацетатный буферный раствор, рН 5. 272 г натрия ацетата трех-водного (х. ч.) вносят в мерную колбу на 1 л, растворяют в неболь­шом количестве бидистиллированной воды, прибавляют 58 мл ле­дяной уксусной кислоты и доводят объем бидистиллированной во­дой до метки. В полученный раствор добавляют 25 мл 50%-ного раствора натрия тиосульфата (натрий серноватистокислый пятиво-дный);

20%-ный раствор соляной кислоты (х. ч.); 0,3 моль/л раствор соляной кислоты;

калибровочный раствор цинка основной. В мерную колбу на 1 л вносят 100 мг металлического цинка, добавляют небольшое ко­личество бидистиллированной воды и 10 мл 20%-ной соляной кис­лоты. После полного растворения цинка доводят объем бидистил­лированной водой до метки. В 1 мл содержится 100 мкг цинка. При отсутствии металлического цинка можно использовать сернокис­лый цинк (х. ч.). С этой целью 0,4396 г реактива (ZnS0₄ • 7 Н2О) растворяют в 1 л бидистиллированной воды, предварительно под­кисленной 5 мл серной кислоты. 1 мл основного раствора содер­жит 100 мкг цинка;

рабочий калибровочный раствор цинка. В мерную колбу на 100 мл вносят 1 мл основного калибровочного раствора и доводят до метки 0,3 моль/л раствором соляной кислоты. В 1 мл содержит­ся 1 мкг цинка. Готовят в день проведения анализов;

очистка четыреххлористого углерода. К 500 мл реактива добав­ляют 10 г активированного угля, встряхивают 5 мин и фильтруют через складчатый бумажный фильтр. Очистку повторяют 2—3 раза с новой порцией угля. После этого четыреххлористый углерод пе­регоняют в стеклянном аппарате на шлифах. Четыреххлористый углерод марки х. ч. и ос. ч. можно использовать без очистки;

50%-ный раствор натрия тиосульфата (х. ч.). 50 г вещества рас­творяют в 50 мл бидистиллированной воды;

серная кислота (х. ч.), разведенная 1:5;

аммиак водный, 25%-ный раствор;

активированный уголь.

Оборудование: фотоэлектроколориметр; муфельная печь; электроплитка; перегонный аппарат стеклянный; тигли фарфоро­вые; делительные воронки на 250 и 500 мл; бюретки на 50 мл.

Ход определения. В фарфоровый тигель вносят 5 мл цель­ной крови (сыворотки, плазмы) и обугливают на электроплитке, постепенно повышая температуру до 200—250 "С. Затем пробы ста­вят в муфельную печь и сжигают при температуре 500—550 "С в те­чение 3—4 ч. Если материал полностью не сгорел, в тигель прили­вают 1—2 мл 50%-ной азотной кислоты, выдерживают на электро­плитке, не допуская разбрызгивания раствора золы, и ставят в муфель на 1 ,ч при температуре 500 °С. При необходимости эту операцию повторяют. Тигель охлаждают. Золу смачивают 5 мл 20%-ного раствора соляной кислоты и осторожно упаривают на электроплитке досуха, не допуская разбрызгивания массы и про­каливания остатка.

В тигель приливают 2,5 мл 20%-ного раствора соляной кислоты, 5 мл дистиллированной воды и нагревают на плитке до растворения золы. Смесь охлаждают, переносят в пробирки с меткой на 25 мл (желательно с притертой пробкой) или в мерные колбы на 25 мл, смывая остатки из тигеля бидистиллированной водой, доводят объем до метки и перемешивают.

В делительную воронку или пробирку с притертой пробкой на 40—50 мл вносят 5 мл раствора золы, прибавляют 10 мл ацетатного буфера и перемешивают. Приливают из бюретки 10 мл рабочего раствора дитизона, встряхивают делительную воронку в течение 1 мин. После разделения фаз органический слой сливают в кювету с толщиной слоя 1 см и фотометрируют на ФЭКе при длине волны 538 нм (зеленый светофильтр) против контроля. При использова­нии пробирок верхний водный слой отсасывают при помощи во­доструйного насоса или шприца или отбирают сразу нижний слой пипеткой с грушей. При хорошем качестве реактивов цвет не дол­жен изменяться в течение суток.

Содержание цинка в образце находят по калибровочной кри­вой. Для построения ее в делительные воронки или пробирки с притертыми пробками вносят 1, 2, 3, 4 и 5 мл рабочего калибро­вочного раствора цинка. Объем до 5 мл доводят 0,3 моль/л раство­ром соляной кислоты. Далее поступают так же, как и с образцами.

Расчет ведут по формуле

„₌ АУ-100 ВС '

где х — количество цинка в пробах, мкг%; А — количество цинка по калибровочной кривой, мкг; У — объем раствора золы, мл; В — количество крови, мл; С — количество раствора золы, взятого для анализа, мл; 100 — коэффициент для пересчета в мкг%.

Примечание. Антикоагулянт — гепарин. Отделить сыворотку или плазму от эритроцитов не позднее чем через 45 мин. Избегать контакта крови с резиновыми пробками. Цельная кровь хранению не подлежит. Сыворотку или плазму можно хранить при ком­натной температуре в течение 1 нед, при 4—8 °С — 2 нед, при -20 "С — до 1 года.

Источники: 52, 73.

Клиническое значение. Влияние цинка на организм проявляется через действие многочисленных ферментов (карбок-сипептидазы, карбоангидразы, щелочной фосфатазы, малатдегид-рогеназы, аргиназы, уриназы и др.), для которых он является не­обходимым компонентом или активатором. При недостатке цинка в организме задерживаются рост, развитие, костеобразование, у поросят появляется паракератоз, у самцов снижается спермопро-дукция. Нормативы цинка в цельной крови, мкг%: крупный рога­тый скот 300—500, свиньи — 400—420; в сыворотке крови: круп­ный рогатый скот 100—150, овцы 100—200, свиньи 100—160.

Содержание цинка чаще определяют в сыворотке крови. Для этого используют химические, полярографические и другие методы. Цинк, марганец, кобальт, железо в кормах и других объектах опре­деляют на атомно-абсорбционном спектрофотометре (С-115 М-1).

Флуориметрический метод определения селена с 2,3-диаминона-фталином. Принцип. Определение селена с 2,3-диаминонафта-лином (2,3-ДАН) основано на способности этого реактива избира­тельно образовывать комплексное соединение с четырехвалент­ным селеном, находящимся в форме селенит-иона (SeO^2-).

Разложение образца проводится смесью азотной и хлорной кис­лот, перевод шестивалентного селена в четырехвалентный реакци-онноспособный селенит-ион достигается нагреванием раствора с концентрированной соляной кислотой.

Четырехвалентный селен в форме селенит-иона (SeOj ) взаи­модействует с 2,3-ДАН с образованием комплексного соединения 4,5-бензопиазоселенола, флуоресцирующего под действием уль­трафиолетовых лучей. Соединение экстрагируют из кислых рас­творов органическими растворителями — циклогексаном, н-гекса-ном, декалином, толуолом. Максимум светопоглощения 4,5-бензо­пиазоселенола в циклогексане находится при 378 нм, максимум флуоресценции — при 520 нм. Интенсивность флуоресценции оп­ределяют на флуориметре. Чувствительность метода 0,001 мкг/г.

Реактивы: азотная кислота концентрированная (х. ч.);

соляная кислота (х. ч.);

0,1 моль/л раствор соляной кислоты из стандарт-титра;

аммиак, водный раствор 1:10;

хлорная кислота (х. ч.), 57%-ный раствор;

комплексон III (динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты, трилот Б), 2%-ный раствор;

аммония персульфат [(N114)28203, х. ч.];

селен металлический (х. ч.);

н-гексан или циклогексан, перегнанные;

0,1%-ный водный раствор 2,3-диаминонафталина. 0,1 г реакти­ва заливают 100 мл 0,1 моль/л соляной кислоты, перемешивают до растворения навески и очищают экстракцией гексаном. Для этого солянокислый раствор 2,3-ДАН вносят в делительную воронку, добавляют 15 мл гексана и встряхивают 1 мин. После разделения фаз солянокислый раствор 2,3-ДАН переливают в другую дели­тельную воронку, а органическую фазу выбрасывают. Добавляют к раствору 2,3-ДАН еще 10 мл гексана и очистку повторяют. Очищенный солянокислый раствор 2,3-ДАН фильтруют и ис­пользуют для анализа. Хранят в склянке темного стекла не более 3—4 дней;

калибровочные растворы селена, содержащие 100, 10,0,1 мкг/мл. Раствор А. Навеску массой 0,1 г металлического селена растворяют в 10 мл концентрированной азотной кислоты сначала на холоде при помешивании, затем при нагревании. Раствор упаривают на водяной бане до влажной массы. Полученную селенистую кислоту (НгБеОз) растворяют в воде, раствор переносят в мерную колбу на 1 л, прибавляют 10 мл концентрированной соляной кислоты и до­водят до метки дистиллированной водой. Раствор А содержит 100 мкг селена в 1 мл.

Более разведенные растворы селена, содержащие 10 мкг в 1 мл (раствор Б) и 0,1 мкг селена в 1 мл (раствор В) готовят последова­тельным разбавлением водой раствора А. Калибровочный раствор В готовят перед использованием;

набор индикаторной универсальной бумаги;

фильтры бумажные обеззоленные, белая лента.

Оборудование: флуориметр ЭФ-ЗМА с ртутнокварцевой лампой, набором кювет и светофильтров; электроплитка мощностью

800 Вт с несколькими степенями накаливания; водяная баня; дели­тельные воронки на 100 и 250 мл; стаканы термостойкие на 50 и 100 мл.

Ход определения. Для анализа берут 1 г почвы, 50—500 мг кормов, 1 г волос, 1 мл цельной крови, 10 мл молока. Измельченный образец (почва, корма, волосы) или необходимый объем крови (молока) помещают в стаканчик на 50 или 100 мл, добавляют 5 мл концентрированной HNO3 и 0,1 г аммония персульфата. Стакан закрывают часовым стеклом и осторожно нагревают на электроплитке. После упаривания воды и частичного разложе­ния материала добавляют 5 мл концентрированной азотной кис­лоты, 3 мл концентрированной хлорной кислоты и нагревают до появления белых паров хлорной кислоты. Если раствор при этом остался темным или желтым, продолжают сильное нагре­вание раствора, добавляя осторожно по каплям в дымящую хлорную кислоту концентрированную азотную кислоту до пол­ного обесцвечивания раствора. После этого стакан снимают с плитки, охлаждают, смывают стенки стакана 2—3 мл воды и снова нагревают стакан на плитке до появления паров хлорной кислоты. Нельзя при этом допускать выпаривания раствора до­суха. На дне стакана должен оставаться остаток хлорной кисло­ты в количестве 0,5 мл.

Чтобы восстановить шестивалентный селен до четырехвалент­ного, к остатку после разложения добавляют 1 мл концентриро­ванной соляной кислоты и нагревают раствор 10 мин на кипящей водяной бане. Затем раствор разбавляют водой до 20 мл.

Устанавливают рН 1 по универсальной индикаторной бумаге, вводя соответственно соляную кислоту или аммиак. Добавляют 2 мл 2%-ного раствора комплексона III, 2 мл раствора 2,3-ДАН и нагревают 5 мин на водяной бане. После охлаждения в течение 10—20 мин раствор переносят в делительную воронку, добавляют 10 мл перегнанного н-гексана и экстрагируют 1 мин. После разде­ления фаз нижний слой (водный) отбрасывают, а экстракт сливают в пробирку и используют для флуориметрического определения се­лена. После окончания экстрагирования серии образцов измеряют флуоресценцию органических растворов на флуориметре ЭФ-ЗМА со светофильтрами ФК-1 (первичный) и В₂-2 (вторичный). Коли­чество селена в пробе, выраженное в мкг, определяют по калибро­вочному графику.

Для построения калибровочного графика из стандартных рас­творов Б и В готовят разведения с содержанием 0,01, 0,02, 0,05, 0,1 и 0,2 мкг/мл селена. Затем в стаканчики на 50 мл вносят по 1 мл раствора селена, доводят объем до 20 мл 0,1 моль/л раствором со­ляной кислоты, устанавливают рН 1 и далее ведут анализ, как опи­сано выше.

В каждой серии готовят холостую пробу, учитывают ее значение при расчете содержания селена.

Расчет ведут по формуле

где х — количество селена в образце, мкг/г (мкг/мл); С — содержание селена в образце, мкг; Р — масса навески, г (мл).

Содержание селена в процентах вычисляют путем умножения найденного количества селена в мкг/г на 0,0001. Например, в об­разце содержание селена составило 0,25 мкг/г, это соответствует 0,25 ■ 0,0001 = 0,000025 % или 2,5 • 10'⁵ %.

Источники: 14, 54.

Клиническое значение. Селен участвует во многих окис­лительно-восстановительных процессах, обладает антиоксидант-ным действием в составе активного центра глутатионпероксидазы. Этот фермент разрушает токсические пероксиды в тканях, благода­ря чему предотвращается жировая дистрофия печени, беломышеч-ная болезнь и др. Данных о нормативах содержания селена в поч­ве, кормах, крови, молоке и других биологических материалах с учетом зональных особенностей недостаточно. Содержание его в кормах колеблется, по данным различных авторов, от 0,01 до 20 мг на 1 кг сухого вещества корма, в цельной крови — от 5 до 18 мкг%, в сыворотке (плазме) — 0,036—0,068 мкг%, в печени — 0,3— 1,2 ч/млн, в волосах — 0,5—0,7 ч/млн.

Считают, что при содержании в кормах селена менее 0,01 мг/кг развивается беломышечная болезнь, возникает дистрофия печени, задержание последа, снижается продуктивность, замедляется рост и развитие. О недостатке в организме селена свидетельствуют низ­кие показатели этого элемента в крови, молоке, волосах, печени и мышцах.

Определение железа в сыворотке крови по цветной реакции с сульфонированным В-фенантролином. Принцип. Белки осаж­дают трихлоруксусной кислотой, которая при прогревании разру­шает также комплекс железа с трансферином. Для установления оптимальной величины рН, равной 4,8—5,0, добавляют аммония ацетат, а для восстановления всего железа — гидрозин. Двухвален­тное железо образует окрашенный комплекс с В-фенантролином, который переведен в сульфатированную форму добавлением хлор-сульфоновой кислоты.

Реактивы: 20 %-ная трихлоруксусная кислота;

аммония ацетат. 70 г аммония ацетата (CH3COONH4) растворя­ют в воде, объем доводят до 100 мл. Препарат гигроскопичен;

гидрозина сульфат, насыщенный раствор. 2,5 г препарата зали­вают 100 мл воды;

раствор сульфонированного В-фенантролина. В пробирке к 100 мг В-фенантролина (4,7-дифинил-1,10-фенантролина) прили­вают 0,5 мл хлорсульфоновой кислоты, нагревают на кипящей во­дяной бане 30 с, охлаждают и медленно приливают 10 мл воды.

После этого снова нагревают на водяной бане 5 мин и разбавляют 100 мл воды. Добавляют 5 моль/л NaOH, устанавливают рН 4 и до­водят объем водой до 200 мл;

калибровочный раствор железа, содержащий 30 мкмоль/л. Сна­чала готовят раствор соли Мора [железоаммонийные квасцы, ам­моний-железа сульфат — FeS0₄ • (NH₄)S0₄ • 6Н₂0], содержащий 3 ммоль/л: растворяют 1,178 г в 5 мл 0,3 моль/л НС1 и доводят объ­ем до 1 л водой, содержащей в 1 л 1 мл концентрированной серной кислоты. Этот раствор разводят подкисленной водой в 100 раз; получается раствор, содержащий 30 мкмоль/л, или 1,67 мкг/мл железа.

Ход определения. К2 мл сыворотки крови (без следов ге­молиза) прибавляют 2,5 мл воды, 1,5 мл 20%-ного раствора трихлор­уксусной кислоты, перемешивают и ставят на 15 мин в водяную ба­ню температурой 90—95 °С. Затем центрифугируют 20 мин при 2000—3000 мин^-1 и отбирают 4 мл прозрачного слоя, к которому приливают 0,35 мл 70%-ного раствора аммония ацетата и 0,3 мл раствора сульфата гидрозина. Смесь фотометрируют при длине волны 535 нм в кювете с длиной оптического пути 1 см, затем при­бавляют 0,4 мл раствора сульфонированного р-фенантролина, ос­тавляют на 1 ч и снова фотометрируют при той же длине волны. Обе фотометрии выполняют против холостой пробы, для которой вместо исследуемой сыворотки берут 2 мл воды. Калибровку про­водят так же, как и основной опыт, но вместо сыворотки берут 2 мл калибровочного раствора.

Расчет сывороточного железа ведут по формуле

где х — количество сывороточного железа, мкмоль/л; Е_оп[ и Е_0П2 — отсчеты опытной пробы до и после прибавления раствора сульфонированного Р-фенантролина; Е_к{, Е_К2 — соответственно результаты калибровочной пробы; 30 — содержание железа в калибровочном растворе, мкмоль/л.

Примечания. 1. Время между взятием крови и получением сыво­ротки не должно превышать 2 ч. При комнатной температуре при хранении в закрытой пробирке же­лезо в сыворотке стабильно 7 дней, при 4—8 °С — 3 нед, при —20 "С — около 1 года. 2. Лабораторную посуду рекомендуется промывать 1%-ным раство­ром ЭДТА с последующим отмыванием бидистил­лированной водой. 3. Если после удаления белков не удается набрать точно 4 мл надосадочной жид­кости, можно взять меньшее ее количество и сде­лать поправку при расчете или же взять точно та­кое же количество калибровочного раствора.

Источник: 43.

Определение железа в сыворотке крови можно проводить с ис­пользованием набора реактивов фирмы «Ла-Хема» (Чехия).

Клиническое значение. Так как подавляющая часть же­леза находится внутри эритроцитов и входит в состав гемоглобина, определение его в цельной крови не имеет практического значе­ния. Представление о его количестве можно сделать по определе­нию гемоглобина. Большее клиническое значение имеет определе­ние железа в плазме (сыворотке) крови, где содержание его в не­сколько раз ниже, чем в цельной крови.

Состояние обмена железа объективно характеризует количество негеминного сывороточного железа, т. е. трансферрина, феррити-на и гемосидерина, так как это основной резерв, который исполь­зуется организмом в случае необходимости.

Трансферрин — растворимый в воде железопротеин, гликопро-теин с содержанием около 0,13 % железа. Он служит физиологи­ческим переносчиком железа в организме.

Ферритин — железосодержащий белок (металлопротеин) с со­держанием железа около 20 %. Он сосредоточен главным образом в селезенке, печени, костном мозге, выполняет роль депо железа в организме.

Гемосидерин — водонерастворимый железосодержащий белко­вый комплекс, в состав которого входят нуклеопротеиды и углево­ды. Содержится главным образом в ретикулоэндотелиоцитах пече­ни и селезенки.

Определение сывороточного железа проводят для выявления железодефицитного состояния. Унифицированным методом опре­деления сывороточного железа является р-фенантролиновый.

Содержание железа в сыворотке крови животных составляет 110—200 мкг/100 мл. Снижение уровня железа в сыворотке крови свидетельствует о развитии железодефицитной анемии, которая часто отмечается у поросят, телят, щенков, ягнят, жеребят, а также у животных других возрастных групп. Причинами ее могут быть недостаточное, скудное, несбалансированное кормление живот­ных; нарушение всасывания железа из пищеварительного тракта при заболевании желудка и кишечника; хронические рецидивиру­ющие кровопотери из желудочно-кишечного тракта (язвенная бо­лезнь); усиленное потребление железа при беременности; замедле­ние мобилизации и нарушение транспорта железа из депо; гипоси-деринемия при избыточном накоплении железа в клетках РЭС; потеря трансферина при нефротическом синдроме и др.

Определение меди и железа в крови по Сенделу в модификации С. Г. Кузнецова. Принцип. Медь с дифинилкарбазоном, а желе­зо с о-фенантролином при определенном рН образуют соедине­ния, придающие растворам определенную окраску, степень кото­рой измеряется на ФЭКе.

Реактивы: 0,5 моль/л раствор хлористоводородной кислоты; 2 моль/л раствор хлористоводородной кислоты;

10%-ный раствор аммиака;

0,1 %-ный водный раствор и-нитрофенола (NO2C6H4OH); 1 %-ный раствор аскорбиновой кислоты;

1 %-ный раствор солянокислого о-фенантролина. Два послед­них раствора хранят в холодильнике в темных склянках; 0,1%-ный раствор фенолфталеина;

0,1 моль/л ацетатный буфер, рН 4. В мерной колбе на 1 л рас­творяют 13,608 г натрия ацетата (СНзСОСЖа • ЗН2О, х. ч.), прили­вают 25 мл ледяной уксусной кислоты (х. ч.) и доводят объем дис­тиллированной водой до метки. Далее буфер фильтруют и опреде­ляют рН. Хранят при температуре 4 "С;

0,01%-ный раствор дифинилкарбазона в бензоле. 10 мг реакти­ва переносят в мерную колбу на 100 мл, добавляют 40—50 мл бен­зола (х. ч.) и нагревают в стакане с горячей водой до растворения реактива. Колбу охлаждают и доводят объем бензолом до метки. Раствор хранят в темной склянке 2 нед;

основной калибровочный раствор железа (100 мкг/мл). 0,8634 г железоаммонийных квасцов f(NH4Fe(S04)2 • I2H2O, х. ч.] раство­ряют в 1 л бидистиллированной воды, подкисленной 5 мл концен­трированной серной кислоты. Для построения калибровочной кривой готовят рабочие растворы, содержащие от 1 до 5 мкг железа в 1 мл. Пробы должны содержать от 0,5 до 20 мкг железа;

основной калибровочный раствор меди (100 мкг/мл). 0,3928 г свежеперекристаллизованной меди сульфата (Q1SO4 • 5Н2О) рас­творяют в 1 л бидистиллированной воды, подкисляют 5 мл кон­центрированной серной кислоты. Для построения калибровочной кривой готовят рабочий раствор, содержащий 2 мкг меди в 1 мл (2 мл основного раствора в 100 мл). Берут 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 1,0, 2,0 и 3,0 мл рабочего раствора, доводят объем до 5 мл дистиллиро­ванной водой, добавляют по 0,5 мл 0,5 моль/л хлористоводородной кислоты, 1 каплю фенолфталеина и далее поступают по ходу опре­деления меди. Пробы содержат 0,2, 0,4, 0,6, 0,8, 1,0, 2,0 или 3,0 мкг меди соответственно. При необходимости следует приготовить се­рию рабочих растворов, содержащих от 0,5 до 5 мкг меди.

Оборудование: фотоэлектроколориметр; тигли фарфоро­вые; муфельная печь; электроплитка; пробирки с притертыми про­бками.

Ход определения. В фарфоровый тигель вносят 2 мл крови для определения меди или 2 мл сыворотки для определения железа, сжигают в муфельной печи при температуре 550—600 °С в течение 5—7 ч. Если озоления полностью не произошло, то тигель охлажда­ют, добавляют 1 мл 50%-ного раствора азотной кислоты, осторожно выпаривают на электроплитке и снова помещают в муфельную печь на 1—2 ч. В тигель приливают 5—6 мл 2 моль/л раствора хлористово­дородной кислоты, доводят до кипения, а затем переносят в пробир­ку с меткой на 10 мл. Тигель споласкивают бидистиллированной во­дой, сливают содержимое в пробирку и доводят объем до метки.

Определение меди. 5 мл раствора золы вносят в пробирку с при­тертой пробкой, прибавляют 1 каплю 0,1%-ного раствора фенол­фталеина, добавляют по каплям 10%-ный раствор аммиака до по­явления светло-розовой окраски. В случае перетитрования вносят по каплям 2 моль/л раствор соляной кислоты до получения нуж­ной окраски. Для точного установления рН прибавляют 1 мл аце­татного буфера. Розовая окраска исчезает. Затем в пробирку вно­сят 5 мл (из бюретки на 50 мл) 0,01 %-ного раствора дифинилкар-базона и встряхивают в течение 1 мин. После расслоения верхний слой приобретает красную окраску, интенсивность которой про­порциональна количеству меди в пробе.

Оптическую плотность верхнего слоя измеряют на ФЭКе при длине волны 540 нм в кювете с толщиной слоя 1 см против конт­роля. Окраска устойчива в течение суток.

Определение железа. 2,5 мл раствора золы вносят в пробирку с меткой на 5 мл, добавляют 1 каплю 0,1%-ного раствора «-нитро­фенола и нейтрализуют 10%-ным раствором аммиака до появле­ния желтой окраски. Добавляют по каплям 0,5 н. раствор хлорис­товодородной кислоты до исчезновения окраски. Затем вносят 5 капель 1 %-ного раствора аскорбиновой кислоты, перемешивают и через 10 мин добавляют 5 капель 1%-ного раствора солянокис­лого о-фенантролина. Доводят объем бидистиллированной водой до метки, перемешивают. Измеряют на ФЭКе при длине волны 540 нм в кювете с толщиной слоя 1 см против контроля. Окраска устойчива в течение суток.

Расчет ведут по формуле

_у= А У- 100 С '

где х — количество меди (или железа), мкг%; А — количество меди (или железа) по калибровочной кривой, мкг; V— объем раствора золы, мл (для меди 10 мл, для железа 5 мл); С — количество раствора, взятого на анализ, мл; 100 — коэффициент для пересчета в мкг%.

Источники: 42, 52.

Клиническое значение. Медь непосредственно участву­ет в гемопоэзе, катализирует включение железа в структуру гена, способствует созреванию эритроцитов, является остеогенным эле­ментом, входит в состав медьсодержащего белка — церулоплазми-на. Она является составной частью цитохромоксидазы, тирозина-зы, уреазы и многих других ферментов. При недостатке ее разви­вается анемия, нарушается пигментация и кератинизация шерсти и пера, наступает дистрофия костей и суставов, снижаются про­дуктивность и репродуктивная функция. Такие явления сопровож­даются снижением меди в крови (норму см. в приложениях 4 и 5).

Избыточное поступление меди ведет к накоплению ее в печени и почках, развивается токсикоз. В этих случаях можно обнаружить повышение концентрации меди в крови.

3.3.11. МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ

В целях диагностики различных заболеваний используют показа­тели активности десятков ферментов и их изоферментов. В клини­ческой практике часто определяют активность аспартатаминотранс-феразы (АсАТ), аланинаминотрансферазы (АлАТ), лактатдегидроге-назы (ЛДГ), щелочной фосфатазы (ЩФ), глутаматдегидрогеназы (ГлДГ), аргиназы, уракиназы, гистидазы, алкогольдегидрогеназы, ци-тохромоксидазы, амилазы, сорбитолдегидрогеназы и многих других.

Определение активности АсАТ и АлАТ в сыворотке крови динит-рофенилгидрозоновым методом (Рейтмана—Френкеля). Прин­цип. В результате переаминирования, происходящего под дейс­твием АсАТ и АлАТ, образуется щавелевоуксусная и пировиног-радная кислоты. Щавелевоуксусная кислота способна в процессе ферментативной реакции превращаться в пировиноградную кис­лоту. При добавлении 2,4-динитрофенилгидрозина в щелочной среде образуется окрашенный гидрозон пировиноградной кисло­ты, интенсивность окраски которого пропорциональна количеству образовавшейся пировиноградной кислоты.

Р е а кт и в ы: 0,1 моль/л фосфатный буфер, рН 7,4. 14,2 г натрия форфата двузамещенного (Na2HP04 • 2Н₂0) и 13,6 г калия фосфа­та однозамещенного (КН2РО4) доводят каждый в отдельности до 1 л дистиллированной водой. Натрий фосфат двузамещенный, содержа­щий две молекулы воды, получают путем двухсуточного выветри­вания на воздухе кристаллической соли (х. ч.), содержащей обычно 12 молекул воды. Соль предварительно растирают в ступке в поро­шок. Для получения буферного раствора рН 7,4 смешивают 840 мл 0,1 моль/л раствора Na2HP0₄ • 2Н₂0 и 160 мл 0,1 моль/л раствора К.Н2РО4. Величину рН буфера доводят под контролем рН-метра. Полученный раствор с индикатором бромтимоловым синим дол­жен давать голубую окраску. К приготовленному раствору в качес­тве консерванта можно добавить 5—10 мл хлороформа;

0,04%-ный раствор бромтимолового синего. 100 мг индикатора растирают в ступке с 3,2 мл 0,05 моль/л раствором натрия гидрок­сида. После растворения смывают водой в мерную колбу на 250 мл и доводят объем водой до метки;

субстратный раствор для определения аспартатаминотрансфе-разы. 29,2 мг ос-кетоглютаровой кислоты и 2,66 г DL-аспарагино-вой кислоты (или 1,33 г L-аспарагиновой кислоты) отвешивают на аналитических весах и растворяют в 1 моль/л раствора натрия гидроксида, который следует прибавлять осторожно, небольши­ми порциями до полного растворения составных частей и до по­лучения рН 7,4. Раствор приливают количественно в мерную кол­бу на 100 мл, ополаскивая 0,1 моль/л фосфатным буфером, рН 7,4. Доливают буфер в колбу до метки, тщательно перемеши­вают, прибавляют 1 каплю хлороформа и сохраняют в холодиль­нике в замороженном виде. Перед употреблением раствор полно­стью оттаивают;

субстратный раствор для определения аланинаминотрансфера-зы. 29,2 мг гх-кетоглютаминовой кислоты и 1,78 г DL-аланина (или 0,89 г L-аланина) отвешивают на аналитических весах. Дальней­шая работа, как и с предыдущим реактивом;

раствор 2,4-динитрофенилгидрозина. 19,8 мг реактива растира­ют в небольшом количестве 1 моль/л раствора соляной кислоты при нагревании на водяной бане. После того как раствор остынет, доводят объем соляной кислотой до 100 мл. На следующий день реактив фильтруют. Раствор хранят в посуде из темного стекла в холодильнике. Годен в течение 1 года;

0,4 моль/л раствор натрия гидроксида, свободный от карбона­тов. Бутыли с реактивом и дистиллированной водой закрывают пробками с поглотительными трубками, наполненными натрон­ной известью или бария гидроксидом;

калибровочный раствор натрия пирувата (СНзСОСОСЖа). 11 мг кристаллического натрия пирувата (белого цвета) растворя­ют в небольшом количестве дистиллированной воды, переносят в мерную колбу на 100 мл и доводят объем до метки водой. 1 мл рас­твора содержит ПО мкг натрия пирувата, что соответствует 88 мкг пировиноградной кислоты.

Оборудование: фотоэлектроколориметр; весы аналитичес­кие; термостат.

Ход определения АсАТ. В пробирку вносят 0,5 мл суб­стратного раствора для определения АсАТ, нагревают при темпе­ратуре 37 "С в течение 5 мин, добавляют 0,1 мл сыворотки и инку­бируют при 37 "С 60 мин. Затем добавляют 0,5 мл 2,4-динитрофе-нилгидрозинового раствора и выдерживают в течение 20 мин при комнатной температуре. Добавляют 5 мл 0,4 моль/л натрия гид­роксида, тщательно перемешивают и оставляют для развития ок­раски на 10 мин при комнатной температуре. Измеряют на ФЭКе при 500—560 нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя 1 см против холостой пробы.

Холостую пробу ставят, как опыт, но сыворотку добавляют пос­ле инкубации.

Ход определения АлАТ. В пробирку вносят 0,5 мл суб­стратного раствора для определения АлАТ и нагревают при темпе­ратуре 37 "С в течение 5 мин. Затем вносят 0,1 мл сыворотки и ста­вят в термостат при 37 °С на 30 мин. Дальнейший ход анализа осу­ществляют так же, как и при определении АсАТ.

Расчет активности ферментов в сыворотке крови проводят по калибровочному графику.

Из калибровочного раствора готовят ряд разведений, как указа­но в таблице 32.

Калибровочные пробы ставят так же, как опытные, но вместо сыворотки добавляют разведенные калибровочные растворы. Из­

меряют против холостой пробы, в которую вместо калибровочного раствора добавляют воду. Калибровочная кривая линейна до вели­чины экстинкции 0,3. Источник: 43.

Примечание. Метод Райтмана—Френкеля положен в основу за­водских наборов реактивов для определения ак­тивности АсАТ и АлАТ, выпускаемых ЧНПП «Фи-лист-диагностика» (Украина), фирмой «Ла-Хема» (Чехия) и др. Исследование активности ферментов в сыворотке или плазме должно быть проведено в день взятия крови. Клиническое значение. Аминотрансферазы переносят аминогруппы от аминокислот к кетокислотам. АсАТ и АлАТ не об­ладают органной специфичностью, однако определение их актив­ности используют для диагностики болезней печени и сердца.

При гепатитах резко повышается активность АлАТ, поражение миокарда сопровождается преимущественно возрастанием актив­ности АсАТ. Нами (И. П. Кондрахин) отмечено резкое повышение активности АсАТ и АлАТ при травматическом перикардите у коров. У здоровых животных активность АсАТ составляет 0,1—0,55 мик­ромолей пировиноградной кислоты на 1 мл сыворотки за 1 ч инку­бации при 37 °С, или 28—154 нмоль/с • л. Активность АлАТ в норме составляет 0,1—0,48 микромолей пировиноградной кислоты на 1 мл сыворотки за 1 ч инкубации при 37 °С, или 28—134 нмоль/с • л.

При синдроме цитолиза гепатоцитов в несколько раз повыша­ется активность не только АлАТ, но и АсАТ. Активность этих фер­ментов в сыворотке крови определяют главным образом для диа­гностики болезней печени и сердца, при которых происходит рас­пад клеток.

Определение активности лактатдегидрогеназы в сыворотке крови по реакции с 2,4-динитрофенилгидрозином (метод Севела—Товаре-ка). Принцип. L-лактат под действием фермента сыворотки в присутствии никотинамид-аденин-динуклеотида (НАД) окисля­ется в пируват, который определяется по цветной реакции с 2,4-ди­нитрофенилгидрозином.

Реактивы: 0,45 моль/л раствор натрия лактата. В мерную колбу на 100 мл вносят 5 мл 80%-ной молочной кислоты (ком­мерческой), добавляют 2 моль/л раствор натрия гидроксида (ч. д. а., х. ч.) до получения рН 7,5 и доводят объем дистилли­рованной водой до метки. Хранят в посуде из темного стекла в холодильнике;

0,03 моль/л раствор натрия пирофосфата, рН 8,8. 6,69 г натрия пирофосфата (Na4P₂07 • ЮН2О, ч. д. а.) растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды, добавляют 1 моль/л раствор соляной кислоты до получения рН 8,8 и доводят объем дистилли­рованной водой до 500 мл. Стабилен 1 мес при хранении в холо­дильнике;

раствор НАД. Готовят из расчета 3 мг НАД на 1 мл дистиллиро­ванной воды. Раствор стабилен 1 мес при хранении в холодильнике;

раствор 2,4-динитрофенилгидрозина. 19,8 мг реактива растворя­ют в небольшом количестве 1 моль/л соляной кислоты при нагре­вании в водяной бане. После охлаждения доводят объем 1 моль/л раствором соляной кислоты до 100 мл. На следующий день реактив фильтруют. Раствор хранят в посуде из темного стекла. Стабилен в течение 1 года;

0,4 моль/л раствор натрия гидроксида;

1 моль/л раствор соляной кислоты;

калибровочный раствор пировиноградной кислоты. 11 мг крис­таллического натрия пирувата растворяют в небольшом количестве бидистиллированной воды, переносят в мерную колбу на 100 мл и доводят объем до метки бидистиллированной водой. 1,0 мл раство­ра содержит 88 мкг пировиноградной кислоты;

рабочий калибровочный раствор готовят разведением основно­го раствора в 10 раз бидистиллированной водой. 1 мл рабочего рас­твора содержит 8,8 мкг пировиноградной кислоты.

Оборудование: фотоэлектроколориметр; термостат; колбы мерные.

Ход определения. 0,1 мл сыворотки, разведенной 1:2, сме­шивают с 0,3 мл раствора НАД, прогревают 5 мин при 37 °С, до­бавляют 0,8 мл 0,03 моль/л раствора натрия пирофосфата и 0,2 мл 0,45 моль/л раствора натрия лактата, предварительно прогретых при 37 "С, и инкубируют смесь при 37 °С в течение 15 мин.

Тотчас же после инкубации добавляют 0,5 мл раствора 2,4-динитрофенилгидрозина, выдерживают 20 мин при комнат­ной температуре. Затем добавляют 5 мл 0,4 моль/л раствора на­трия гидроксида, перемешивают. Через 10 мин измеряют экс-тинкцию раствора на ФЭКе в кювете с толщиной слоя 1 см при длине волны 500—560 нм (зеленый светофильтр) против холос­той пробы.

Холостую пробу ставят так же, как опытную, но сыворотку до­бавляют после инкубации.

Расчет активности проводят по калибровочному графику. Активность лактатдегидрогеназы выражают в микромолях пирови­ноградной кислоты, образовавшейся при инкубации 1 мл сыворот­ки в течение 1 ч при 37 °С, или нмоль/с • л.

Построение калибровочного графика. Из рабочего калибровочно­го раствора натрия пирувата готовят ряд разведений, как указано в таблице 33.