29. Основные принципы и методы лабораторной диагностики малярии, особенности «толстой» капли и мазка.

Исследование мазков крови В настоящее время, несмотря на появление других методов, микроскопическое исследование мазков крови остается "золотым стандартом" для диагностики малярии. Исследования мазка крови позволяет выяснить следующее: 1. инфицирован ли больной 2. вид и стадию жизненного цикла плазмодия 3. уровень паразитемии (количество паразита в 1 мкл крови).  При правильном осуществлении этот метод имеет значительную чувствительность. Порог определения возбудителя при "тонкой капле" составляет 100 паразитов/мкл. Для "толстой капли" этот порог ниже - около 5-20 паразитов/мкл. В обоих случаях точность зависит в основном от опыта микроскописта. В целом, исследование мазков крови простой и недорогой метод, но все же требует значительную рабочую силу и достаточно времени для просмотра 100 микроскопических полей на каждый мазок. Также необходимы соответствующее оборудование, реактивы и тренированный персонал.  Подробные руководства по сбору крови и подготовке мазка предоставляются со стороны ВОЗ и Центра по контролю и предупреждению заболеваний и могут быть получены с нашей интернет- странички. Имеется также информация о микроскопической картине различных стадий и видов плазмодия ([Интерпретация мазков крови). Каждая клиника в мире имеет свою специфику приготовления кровяных мазков для диагностики малярии, тем не менее существуют общие принципы, которые должны соблюдаться.  Как правило, мазок должен быть приготовлен как можно раньше после взятия венозной крови. Это позволяет предотвратить возможные изменения в морфологии возбудителя и обеспечить хорошее окрашивание. Особое внимание следует обратить на стадию фиксации при приготовление препарата. Необходимо избегать случайной фиксации "толстой капли" метанолом, особенно, если и "толстая капля", и "тонкий мазок" находятся на одном предметном стекле. Исследователь должен дождаться испарения спирта на пальцах исследуемого перед приготовлением "толстой капли". Необходимо избегать фиксации "толстой капли" при одновременном высушивании предметного стекла при помощи искусственного тепла. 

Таким образом, до окрашивания "тонкий мазок" фиксируется метанолом; "толстая капля" окрашивается без фиксации. Многие больницы используют краску Райт-Гимзы (Wright-Giemsa), которая вполне приемлема; тем не менее, только краска Райт недостаточно хорошо окрашивает плазмодии. Для лучшего результата мазок должен окрашиваться при помощи 3% раствора Гимзы (pH 7.2) на 30-45 минут. 

Правильная толщина " толстой капли" может быть оценена при помощи четкости печатного текста, видимого сквозь предметное стекло. Печатный текст должен быть лишь слегка разборчивый. При ограниченности ресурсов, "толстая капля" и "тонкий мазок" могут готовиться на одном предметном стекле. Всегда необходимо исследовать и "толстую каплю", и "тонкий мазок". Оба дают важную информацию для диагностики малярии (Таблица1). 

Таблица 1. Характеристика толстой капли и тонкого мазка

Толстая капля	Тонкий мазок
Гемолизированные эритроциты	Фиксированные эритроциты
Много слоевs	Один слой
Больший объем	Меньший объем
Хороший скрининг-тест	Хорошая дифференциация видов
Определяет инфекцию даже при низкой паразитемии	Инфекция с низкой паразитемией может быть пропущена
Затруднена дифференциальная диагностика видов	Требует больше времени для интерпретации

Нижеприведенные таблицы могут быть использованы для дифференциации видов плазмодия как на "толстой капле", так и в "тонком мазке" (Таблицы 2-3). 

Таблица 2. Дифференциация видов плазмодия в "тонком мазке".

Признак	P. falciparum	P. vivax	P. ovale	P. malariae
Пораженный эритроцит увеличен		+	+
Форма пораженного эритроцита	округлая	округлая, деформированная	овальная, ворсинчатая	округлая
Зернистость эритроцита	пятна Маурэра	пятна Шуффнера	пятна Шуффнера	нет
Форма трофозоита	маленькие кольца, поверхностные формы	большие кольца, амебовидные	большие кольца, компактные	маленькие кольца, компактные
Зерна хроматина	двойные	единичные	крупные	единичные
Зрелый шизонт	редко, 12-30 мерозоитов	12-24 мерозоитов	4-12 мерозоитов	6-12 мерозоитов
Гаметоцит	серповидной формы	большой, округлый	большой, округлый	компактный, округлый

Таблица 3. Дифференциация видов плазмодия в "толстой капле".

Признак	P. falciparum	P. vivax	P. ovale	P. malariae
Однородные трофозоиты	+
Фрагментированные трофозоиты		++	+
Компактные трофозоиты			+	+
Пигментированные трофозоиты				+
Неоднородная цитоплазма		+	+
Зернистость		+	+
Шизонты обнаруживаются	крайне редко	часто	часто	часто
Гаметоциты обнаруживаются	случайно	обычно	обычно	обычно

Определение количества циркулирующих возбудителей чрезвычайно важно в клинических целях, для наблюдения за развитием заболевания и эффективностью лечения. Были предложены различные методы:

1. Число паразитов в 1 мкл крови ("толстая капля"): Этот метод требует исследования по возможности большого количества микроскопических полей (иммерсионный окуляр100x), необходимых для подсчета 200 лейкоцитов. Количество бесполых возбудителей и лейкоцитов должно подсчитываться в каждом поле, пока количество лейкоцитов не достигнет 200.

Если количество лейкоцитов неизвестно, предполагается, что они составляют 8000/мкл.

2. Количество паразитов/мкл крови ("тонкий мазок"): Этот метод требует предварительного определения количества эритроцитов, имеющихся в среднем микроскопическом поле.

Количество бесполых форм возбудителя подсчитывается как минимум в 25-и микроскопических полях. Число эритроцитов в среднем микроскопическом поле составляет 200, следовательно, общее количесвтво эритроцитов в 25 полях около 200*25 = 5000. Если гемограмма отсутствует, предполагается, что эритроциты составляют 5.000.000 на мкл для мужчин и 4.500.000 для женщин.

3. Отношение пораженных эритроцитов к общему количеству эритроцитов ("тонкий мазок"): Этот метод определяет процент эритроцитов, инфицированных возбудителями малярии.

Число пораженных эритроцитов (бесполых форм), имеющихся в 25 микроскопических полях, делится на общее количество эритроцитов, имеющихся в этих полях (около 5000), и умножается на 100.

4. Полуколичественное исчисление ("толстая капля"): Это альтернативный метод определения концентрации возбудителя, он более быстрый, но менее точный. Он должен использоваться, только если невозможно использовать более точные методы. Используется следующая шкала.

+		1-10 бесполых форм паразита в 100 полях "толстой капли"
++		11-100 бесполых форм паразита в 100 полях "толстой капли"
+++		1-10 бесполых форм паразита в одном поле "толстой капли"
++++		> 10 бесполых форм паразита в одном поле "толстой капли"

Необходимо знать, что концентрация возбудителя в крови взаимосвязана с тяжестью клинических проявлений (Таблица 4.). 

Таблица4. Соотношение паразитемии и клинического проявления малярии

Паразитемемия	PПаразиты / мкл	Замечания
0.0001-0.0004%	5-20	Чувствительность толстой капли капли
0.002%	100	В регионах с сезонной малярией, симптомы могут проявляться при паразитемии ниже этого уровня
0.2%	10,000	Выше этого уровня клиника проявляется у лиц с иммунитетом
2%	100,000	Максимальная паразитемия при P.vivax и P.ovale
2-5%	100,000-250,000	Гиперпаразитемия/тяжелая малярия*, повышенная смертность
10%	500,000	Рекомендуется переливание крови/высокая смертность
*Согласно ВОЗ критерии тяжелой малярии: паразитемия > 10,000 /мкл и выраженная анемия (гемоглобин < 5 г/л). Прогноз неблагоприятный, если пигментированные трофозоиты и шизонты (преобладают зрелые формы) составляют > 20% паразитов и/если > 5% нейтрофилов содержат видимый пигмент. Hдnscheid T. (1999) Diagnosis of malaria: a review of alternatives to conventional microscopy. Clin Lab. Haem. 21, 235-245.