Глава III методы микроскопического исследования микробов

Методы микроскопического исследования микроорга­низмов используют при изучении формы и структуры клетки, определении подвижности микробов, изучении включений микробной клетки.

Микроскопия в световом, оптическом микроскопе

Микроскоп является сложным оптическим прибором, оптическая часть которого смонтирована на специ­альном штативе. Штатив состоит из основания и отходя­щей от него колонки, к которой прикреплены подвижно тубус и столик микроскопа, С колонкой связаны две вин­товые системы для установки тубуса микроскопа: макро- метрический винт, позволяющий быстро передвигать ту­бус, и микрометрический винт для детальной, более точной установки его. Внизу тубуса расположен объек­тив— увеличивающая оптическая система, которая дает действительное изображение рассматриваемого объекта. Для обозначения силы увеличения на объективах указы­вается увеличение: 10 X, 40 X, 90X. Даваемое объекти­вом изображение увеличивается при помощи второй системы увеличительных стекол, составляющих окуляр. Он находится в верхнем конце тубуса и увеличивает дей­ствительное изображение в 8—10—15 раз. В большинстве микроскопов свет отражается от регулируемого зеркала, расположенного у основания микроскопа. Пройдя через линзу конденсора, свет фокусируется на объекте. В со­временных микроскопах зеркало и конденсор замене­ны вмонтированным в прибор регулируемым источником света (рис. 18). Разрешающая сила светового микроскопа, определяющая возможность прибора давать отдельное изображение каждой из двух близлежа­щих точек объекта, зависит от длины волны видимого

света (X) и численной апертуры (NA) линз объектива. Предел разрешающей способности микроскопа, т. е. ми­нимальное расстояние между двумя точками, при кото­ром можно различить каждую из них, определяется по формуле:

х

предел разрешения = .

Величина численной апертуры определяется соотно­шением NA = /2*Sina, где п — показатель преломления среды; Sin a — синус половины апертурного угла. Так как показатель преломления материалов, используемых в оптическом микроскопе, не выше 1,6, а Sin a^l, то максимальная численная апертура линз иммерсионного

объектива составляет пример­но 1,4. Длина волны видимого света равна 520—610 нм. По­этому предел разрешения оп­тического микроскопа, вычис­ленный по формуле, составля­ет 200—250 нм (0,2—0,25 мкм). Для увеличения разрешающей силы микроскопа, т. е. умень­шения предела разрешения, используют свет с меньшей длиной волны, например ульт­рафиолетовый с длиной волны 200—300 нм (люминесцентная микроскопия).

Рис. 19. Камера с висячей каплей.

Способы приготовления пре­паратов для микроскопии. При помощи светового мик­роскопа можно изучать микроорганизмы как в живом, так и в окрашенном состоянии. При исследовании мик­робов в живом состоянии можно получить представление о размерах, форме и характере движения, если микробы подвижны. Иногда внутри живой клетки видны блестя­щие, сильно преломляющие свет гранулы и споры. В ди­зентерийной амебе, например, хорошо видны захвачен­ные ею эритроциты.

Для изучения микробов в живом состоянии готовят препараты висячей капли и раздавленной капли. Для приготовления препарата висячей капли (рис. 19) бактериологической петлей в центр покровного стекла наносят небольшую каплю исследуемого материала, суспендированного в жидкости. Затем берут специальное предметное стекло с луночкой в центре и края ее смазы­вают вазелиновым маслом. Луночкой предметного стекла накрывают каплю исследуемого материала на покровном стекле так, чтобы капля находилась в центре луночки. Слегка прижимают предметное стекло и быстро перево­рачивают. При правильном приготовлении препарата капля свободно свисает в луночку. Вазелиновое масло предохраняет ее от высыхания.

Препарат раздавленной капли готовят, нанося каплю материала, суспендированного в жидкости, на предметное стекло, которое затем накрывают покровным.

Окраска микроорганизмов. Для изучения деталей структуры микроорганизмов обычно пользуются методом

окраски бактерий анилиновыми красителями. Исследуе­мый материал разводят физиологическим раствором, не­большую каплю взвеси наносят тонким слоем на пред­метное стекло диаметром 1 см и высушивают. Такой пре­парат называют мазком. Мазок фиксируют на пламени горелки, если исследуют бактерии, и этиловым или мети­ловым спиртом при микроскопии простейших, риккетсий, спирохет.

Большинство красителей, используемых в микробио­логии, является солями двух типов. Кислые красители (эозин) более интенсивно связываются с цитоплазмати­ческими (основными) компонентами клетки. Основные красители (метиленовый синий) выступают в соединение с ядерными (кислыми) компонентами клетки. Некоторые красители не образуют химических соединений с компо­нентами микробной клетки, а просто покрывают ее по­верхность, адсорбируясь, растворяясь или осаждаясь на окружающем материале. В механизме окраски имеют значение как химические, так и физические процессы.

Для окраски бактерий применяют простые методы. Основные красители: метиленовый синий, кристалличе­ский фиолетовый, основной фуксин. Широко используют раствор метиленового синего — краску Леффлера, даю­щую возможность выявить детали формы и структуры микробов. Его готовят из двух растворов: первый — ме­тиленовый синий (0,3 г) и 96% этиловый спирт (30 мл), второй — 0,01% раствор едкого кали (100 мл). Раствор красителя наносят на мазок, предварительно фиксиро­ванный пламенем, на полминуты, краску смывают водой. Мазок просушивают между листами фильтровальной бу­маги (осторожно!) и изучают под микроскопом.

Сложные способы окраски применяют для выявления спор, капсул, жгутиков, различных структур и органелл микробной клетки, а также для дифференциации сход­ных.по форме бактерий.

Способ окраски по Граму позволяет диффе­ренцировать сходные по форме и размерам бактерии, относящиеся к разным видам и родам. Мазок, приготов­ленный из исследуемого материала, окрашивают вначале кристаллическим фиолетовым в течение 1—2 мин, а затем раствором Люголя 1—2 мин. Все микроорганизмы, нахо­дящиеся в мазке, окрашиваются в темно-фиолетовый цвет. После этого мазок промывают 96% этиловым спир­том в течение 30 с—1 мин. Под влиянием спирта одни

бактерии обесцвечиваются, а другие сохраняют фиолето­вую окраску, приданную им комплексом красителя с йо­дом. Те виды микробов, которые сохраняют фиолетовую окраску, называют грамположительными, а те, что обес­цвечиваются,— грамотрицательными. После дополнитель­ной окраски фуксином последние окрашиваются в крас­ный цвет. Необходимо помнить, что на результаты окрас­ки по Граму часто оказывают влияние небольшие откло­нения в условиях культивирования или в методике окраски. Старые культуры или отмирающие клетки грам- положительных бактерий могут стать грамотрицательны- * ми. В кислой среде, как правило, все микробы грамотри­цательны. При окраске по способу Грама все бактерии разделяются на две группы: грамположительные (стафи­лококки, стрептококки, пневмококки, возбудители сибир­ской язвы, столбняка, газовой гангрены и др.) и грамот- рицательные (менингококки, гонококки, возбудители брюшного тифа, дизентерии и др.).

Между большинством грамположительных и грам- отрицательных бактерий существуют характерные отли­чия. Например, грамположительные бактерии значитель­но чувствительнее к действию сульфаниламидов, пени­циллина и лизоцима, чем грамотрицательные. Они отличаются также химическим составом клеточных сте­нок. Считают, что различия в окраске по Граму основы­ваются на разной проницаемости клеточных стенок бактерий, наличии рибонуклеата магния у грамположи­тельных бактерий и различий в количестве гликопепти­дов в стенках бактерий.

Способ окраски по Цилю — Нильсену предложен для кислотоустойчивых микроорганизмов, микобактерий туберкулеза и бактерий лепры. Эти микроорганизмы имеют своеобразный химический со­став, отличающийся высоким (до 30 — 40%) содержа­нием особых восков — жироподобных веществ. Спо­соб заключается в том, что предварительно фик­сированный на пламени мазок из мокроты больного туберкулезом окрашивают раствором карболового фукси­на при дву-, троекратном подогревании до появления па­ров. Видимо, благодаря размягчению воска краска про­никает и удерживается в клетке даже при последующей обработке препарата 5% серной кислотой в течение 3—

5 с; кислотоустойчивые микобактерии остаются окрашен­ными в красный цвет. Остальные микробы обесцвечива-

ются под действием кислоты и при дополнительной окраске метиленовым синим становятся синими.

Для окраски спор, которые при обычных мето­дах окраски имеют вид неокрашенных пустот, применяют протравы: кислоты и щелочи. Они разрыхляют плотную оболочку споры и облегчают проникновение в нее краски. Окрасившиеся споры обладают кислотоустойчивостью и не обесцвечиваются под действием кислоты в отличие от вегетативного тела микробной клетки. Поэтому прин­цип окраски спор и кислотоустойчивых бактерий одина­ков: препараты окрашивают основной краской, затем обесцвечивают кислотой и докрашивают дополнительно в какой-либо другой цвет.

Споры можно окрасить по методу Циля — Нильсена (споры — красные, вегетативное тело — синее) или по методу Ожешко. Для этого на высушенный, но нефикси­рованный мазок наливают несколько капель 0,5% рас­твора соляной или серной кислоты и подогревают над пламенем горелки в течение 1—2 мин до закипания. Ос­татки кислоты сливают, препарат высушивают, фиксиру­ют в пламени. Дальнейшую окраску производят по мето­ду Циля — Нильсена.

Капсулы при обычных методах окраски остаются бес­цветными. Это позволяет применять простые методы окраски для выявления капсул микроорганизмов в мазках из органов и тканевой жидкости. Например, при окраске метиленовым синим ткани и клетки бактерий окрашиваются в голубой цвет, а вокруг бактерий сохра­няется бесцветная зона — капсула.

Из специальных методов окраски применяют способ Бурри: на край стекла наносят каплю туши и каплю исследуемого материала, перемешивают их, делают ма­зок (так же, как мазок крови), высушивают и микро- скопируют с иммерсионной системой. Фон препарата окрашен в темно-дымчатый цвет, тела микробов и их капсулы тушью не окрашиваются и остаются бесцветны­ми — негативный способ окраски.

Негативный метод Гинса сочетает окраску тушью и фуксином. Мазок окрашивают по способу Бур­ри, затем высушивают, фиксируют спиртом и докраши­вают фуксином Циля. Фон препарата черный, капсула не окрашена, бактериальная клетка красная.

Зерна волютина, которые обнаруживают у возбудите­лей дифтерии, окрашивают по способу Нейссера. Этот

сложный метод окраски включает несколько этапов: ок­раска фиксированного на пламени горелки мазка уксус­нокислой синькой (1—2 мин), затем добавление на мазок нескольких капель раствора Люголя на 1 мин и промыва­ние водой. Препарат докрашивают раствором хризоидина или везувина в течение 2—3 мин, промывают водой, вы­сушивают и микроскопируют. Зерна волютина окраши­ваются в синий цвет, микробные клетки — в светло-ко­ричневый.

Методы окраски жгутиков — осаждение на них тани­на, который действует как протрава, т. е. способствует фиксации красителя на окрашиваемом объекте (метод Лейфсона).

Для окраски простейших, а также спирохет и риккет­сий широко применяют окраску по способу Рома-* новского—Г имзы. Используемая краска состоит из смеси азура, эозина и метиленового синего. Непосред­ственно перед употреблением ее растворяют дистиллиро­ванной или водопроводной водой (pH 7,0—7,2) из расче­та 1:10. Препарат фиксируют этиловым или метиловым спиртом в течение 5—15 мин, высушивают и микроскопи­руют. Ядро простейших, жгутики и блефаропласт окра­шиваются в ярко-красный цвет, цитоплазма — в голубой, спирохеты и риккетсии — в сиреневато-синий или ро­зовый.

Присутствие ДНК в клетках микроор­ганизмов можно определить с помощью реакции Фельгена и ее модификаций. Этот способ основан на способности ядерного материала окрашиваться в темно- пурпурный цвет при обработке реактивом Шиффа (фук­син, обесцвеченный сернистой кислотой). Предваритель­но фиксированный мазок обрабатывают горячим (60°С)

1 н. раствором соляной кислоты в течение 7—8 мин для разрушения (гидролиз) РНК, наличие которой, особенно в бактериях, затрудняет выявление ДНК. Можно также разрушить РНК специальным ферментом рибонуклеазой, а для окраски использовать красители, предложенные Романовским (азур I—II и эозин).

МИКРОСКОПИЯ В ТЕМНОМ ПОЛЕ

Исследование микроорганизмов в темном поле (тем­нопольная микроскопия) основано на явлениях рассея­ния света при сильном боковом освещении взвешенных

в жидкости частиц. Микроскопия в темном поле зрения позволяет увидеть более мелкие частицы, чем в световом микроскопе. Она осуществляется с помощью обычного светового микроскопа, снабженного специальными кон­денсорами (параболоид- или кардиоид-конденсор), кото­рый создает полый конус света. Вершина этого полого конуса совпадает с объектом. Лучи света, проходя через объект исследования в косом направлении, не попадают в объектив микроскопа. В него проникает только свет, рассеянный объектом.

При этом на темном фоне наблюдаются ярко светя­щиеся контуры микробных клеток и других частиц. Мик­роскопия в темном поле зрения позволяет определить форму микроба и его подвижность. Обычно темно­польная микроскопия используется при исследовании микроорганизмов, которые слабо поглощают свет и не видны в световом микроскопе, как, например, спи­рохеты.

Для создания темного поля можно также использо­вать обычный конденсор Аббе, поместив в центр его кру­жок черной бумаги. В этом случае свет устанавливают и центрируют по световому полю, а затем затемняют кон­денсор Аббе.

Препарат для микроскопии готовят по методу раз­давленной капли. Толщина предметного стекла не дол­жна превышать 1—1,1 мм, иначе фокус конденсора придется в толщу стекла. Между конденсором и предмет­ным стеклом помещают жидкость (дистиллированная вода) с показателем преломления, близким к показа­телю преломления стекла. При правильной установке освещения на темном поле видны яркие, светящиеся точки.