9. Методы учета мутаций

Особенности методов учета мутаций. Методы обнаружения мутаций должны быть разными в зависимости от способа размножения организма. Видимые морфологические изменения учитываются легко; сложнее определить физиологические и биохимические изменения у многоклеточных организмов. Легче всего обнаруживаются видимые доминантные мутации, которые могут проявляться в гетерозиготном состоянии в первом же поколении, труднее анализировать рецессивные мутации, их необходимо переводить в гомозиготное состояние.

Для хорошо изученных в генетическом отношении объектов (дрозофила, кукуруза, ряд микроорганизмов) изучение новой мутации проводить довольно легко. Например, для дрозофилы разработаны специальные методики учета частоты мутаций.

Метод СlВ. Герман Мёллер создал линию дрозофил СlВ (Си Эль Би) у которой одна из Х-хромосом маркирована доминантным геном Bar (В) и инверсией, названной С. Эта инверсия препятствует кроссинговеру и обладает рецессивным летальным эффектом – l. Поэтому линия и названа СlВ.

Самок этой линии-анализатора скрещивают с самцами из исследуемой выборки. Если самцы взяты из природной популяции, то можно оценить частоту леталей в ней. Или же берут самцов, обработанных мутагеном. В этом случае оценивается частота летальных мутаций, вызванных этим мутагеном.

В F₁ отбирают самок СlВ/+, гетерозиготных по мутации Bar, и скрещивают индивидуально (каждую самку в отдельной пробирке с самцом дикого типа). Если в проверяемой хромосоме нет мутации, то в потомстве будет два класса самок и один класс самцов (B⁺), поскольку самцы СlВ гибнут из-за наличия летали l, т.е. общее расщепление по полу будет 2:1 (см. рисунок).

Если же в опытной хромосоме есть летальная мутация l_m, то в F₂ будут только самки, так как самцы обоих классов погибнут – в одном случае из-за наличия летали в Х-хромосоме СlВ, в другом – из-за наличия летали l_m в опытной Х-хромосоме (см. рисунок). Определяя отношение числа Х-хромосом (пробирок с индивидуальными скрещиваниями), в которых возникла леталь, к общему числу изученных Х-хромосом (пробирок), подсчитывают частоту летальных мутаций в определенной группе.

Мёллер неоднократно модифицировал свой метод выявления леталей в Х-хромосоме дрозофилы, в результате чего появились такие линии - анализаторы, как Mu-5, а позднее – линии - балансеры Basc, Binsn и др.

Метод Cy L/Pm. Для учета летальных мутаций в аутосомах дрозофилы используют линии сбалансированных леталей. Для проявления рецессивной летальной мутации в аутосоме тоже необходимо, чтобы она оказалась в гомозиготном состоянии. Для этого необходимо поставить два скрещивания, а учет потомков вести в F₃. Для обнаружения леталей во второй хромосоме используют линию Cy L/Pm (Сай Эл Пи Эм) (см. рисунок).

У мух этой линии во второй хромосоме расположены две доминантные мутации Cy (Curly – загнутые крылья) и L (Lobe – маленькие дольковидные глаза), каждая из которых в гомозиготном состоянии вызывает летальный эффект. Мутации представляют собой протяженные инверсии в разных плечах хромосомы. Обе они «запирают» кроссинговер. В гомологичной хромосоме также присутствует доминантная мутация – инверсия Pm (Plum – коричневые глаза). Анализируемого самца скрещивают с самкой из линии Cy L/Pm (на рисунке показаны не все классы потомков).

В F₁ отбирают самцов Cy L/Pm⁺ и индивидуально скрещивают их с самками исходной линии Cy L/Pm. В F₂ отбирают самцов и самок Cy L, у которых гомологичная хромосома является испытуемой. В результате скрещивания их между собой получается три класса потомков. Один из них погибает из-за гомозиготности по мутациям Cy и L, еще один класс потомков – это гетерозиготы Cy L/Pm⁺, а также класс гомозигот по испытуемой хромосоме. В итоге получаются мухи Cy L и Cy⁺ L⁺ в соотношении 2:1.

Если в испытуемой хромосоме произошла летальная мутация, в потомстве от последнего скрещивания будут только мухи Cy L. С помощью такого метода можно учитывать частоту рецессивных летальных мутаций во второй хромосоме дрозофилы.

Учет мутаций у других объектов. Аналогичные методы обнаружения мутаций разработаны и для других объектов. В основу их положены те же принципы:

1) обнаружить рецессивную мутацию можно, переводя ее в гомо- или гемизиготное состояние,

2) учесть точно частоту возникающих мутаций можно лишь при условии отсутствия кроссинговера у гетерозиготных особей.

Для млекопитающих (мышь, кролик, собака, свинья и др.) разработана методика учета частоты возникновения доминантных летальных мутаций. О частоте мутаций судят по разнице между числом желтых тел в яичнике и развивающихся эмбрионов у вскрытой беременной самки.

Учет частоты возникновения мутаций у человека очень затруднен, однако генеалогический анализ, т.е. анализ родословных, позволяет установить возникновение новых мутаций. Если в родословной супругов в течение нескольких поколений не встречался какой-то признак, а у одного из детей он появился и стал передаваться следующим поколениям, значит мутация возникла в гамете одного из этих супругов.

Учет мутаций у микроорганизмов. Изучать мутации у микроорганизмов очень удобно, так как все гены у них в единственном числе и мутации проявляются уже в первом поколении.

Мутантов легко обнаружить методом отпечатков, или реплик, который предложили супруги Э. и Дж. Ледерберги.

Для выявления у Е. сoli мутаций устойчивости к бактериофагу Т1 бактерии высевают на питательный агар, чтобы образовались отдельные колонии. Затем при помощи бархатной реплики эти колонии перепечатывают на чашки с нанесенной суспензией частиц фага Т1. Большая часть клеток исходной чувствительной (TonS) культуры не будет образовывать колоний, поскольку их лизирует бактериофаг. Вырастут лишь отдельные мутантные колонии (TonR), устойчивые к фагу. Подсчитывая число колоний в контрольном и опытном (например, после облучения ультрафиолетовым светом) вариантах, легко определить частоту индуцированных мутаций.