1.2. Энхансеры

Чтобы транскрипция какого – либо гена пошла, нужен промотор, а чтобы она происходила интенсивно, необходимы энхансеры.

В 1981 г. Дж. Банерджи, С. Раскони и С. Шеффнер обнаружили некую последовательность нуклеотидов у вируса SV40, которая в сотни раз усиливала транскрипцию гена β-глобина, если связывалась с ним. Авторы назвали подобные последовательности энхансерами (усилителями).

Энхансеры отличаются от промоторов в трех отношениях:

- во-первых, расстояние, на которое они удалены от точки инициации транскрипции, не является фиксированным;

- во-вторых, это расстояние очень большое;

- в-третьих, многие энхансеры могут располагаться не только в 5'-, но и в 3'-области, и в середине гена.

С энхансерами специфически связываются регуляторные белки (специфические факторы транскрипции), активирующие процесс транскрипции.

Как эти белки могут действовать на больших расстояниях?

Согласно самой простой модели, ДНК между энхансером и промотором образует петлю, в результате чего белки, связанные с энхансером, непосредственно взаимодействуют с одним из общих факторов транскрипции или с молекулой самой РНК-полимеразы.

Разнообразие общих факторов транскрипции невелико, но каждый из них представлен в клетке большим количеством копий, поскольку связывается с промоторами всех генов, транскрибируемых РНК-полимеразой II. Кроме этого в клетке существуют тысячи различных специфических факторов транскрипции, связывающихся с регуляторными участками ДНК. Их наборы различаются в разных клетках и у разных генов. Каждый из этих белков представлен малым числом молекул и распознает свою особую последовательность нуклеотидов в регуляторных участках. С помощью этих белков-регуляторов каждый ген специфически включается или выключается, т. е. для генов, характерных для каждого органа или ткани, есть свой белок-регулятор и свой энхансер.

У дрожжей имеются последовательности, по своему действию похожие на энхансеры, которые называются UAS (upstream activating sequences). Как и энхансеры, они могут функционировать в любой ориентации и на различных расстояниях от промотора. Однако, в отличие от энхансеров, UAS не могут работать, когда локализованы ниже промотора. UAS-последовательности активируются, когда с ними связываются белки GAL4.

Недавно был разработан метод направленной экспрессии генов у дрозофилы с использованием энхансеров. Суть его заключается в том, что исследователи создают две трансформированные линии мух. Для создания первой линии в Р-элемент наряду с обычными маркерами вводится ген, кодирующий белок GAL4.

Такой транспозон встраивается в случайные районы хромосом дрозофилы, в том числе может попасть под какой-нибудь энхансер, например, под энхансер гена, работающего в клетках формирующегося крыла или ноги. Поэтому GAL4 будет экспрессироваться в клетках крыла или ноги, однако никаких последствий для этих клеток не будет, поскольку белок GAL4 может активировать транскрипцию другого гена лишь в том случае, если он свяжется с промотором UAS, который в норме присутствует только в геноме дрожжей.

Поэтому создают вторую линию дрозофилы, которую трансформируют транспозоном, содержащим испытуемый ген X, сшитый с промотором UAS. Когда в результате скрещивания двух линий оба транспозона объединяются в геноме потомка, ген GAL4 начинает функционировать в тех клетках, в которых активен его энхансер. Белок GAL4 связывается с промотором UAS, который и «включает» ген X. При этом индукция X будет наблюдаться совсем не в той ткани, в которой он активируется своим собственным энхансером, а в той, где функционирует энхансер гена GAL4. Такая экспрессия называется эктопической, т. е. «не на своем месте».

Интересный пример использования этого методического подхода связан с работами Вальтера Геринга (р. 1939) по изучению генетики развития глаз у дрозофилы и некоторых других животных. Мутации некоторых генов, например eyeless у дрозофилы, приводят к полному отсутствию глаз. В результате сопоставления молекулярной организации генов Aniridia у человека, Small eye у мыши и eyeless у дрозофилы было найдено значительное их сходство. Это тем более удивительно, что анатомически глаза у мухи и млекопитающих очень мало напоминают друг друга.

В 1995-1996 гг. В. Геринг с сотрудниками получили гетерозиготных мух при скрещивании двух линий с мутацией eyeless, содержащих транспозоны с GAL4 и UAS. GAL4 находился под контролем энхансера, функционирующего в клетках развивающихся ног, крыльев и органов головного комплекса. В транспозон, содержащий UAS, на место гена X была встроена ДНК нормального аллеля гена eyeless. В результате функционирования гена eyeless появились, во-первых, нормальные глаза, а также маленькие глаза в разных участках крыльев, ног, на голове — там, где был активен энхансер.

Затем был поставлен еще более смелый эксперимент: на место гена X в транспозон с UAS встроили ДНК гена Small eye, выделенную из генома мыши. И опять начали формироваться сложные глаза, характерные для дрозофилы, в разных участках тела мухи . Как же могло получиться, что действие гена, контролирующего развитие глаза у мыши, привело к развитию глаза совершенно другого типа у дрозофилы?

Оказалось, что в процессах формирования глаз у животных принимает участие около 2,5 тыс. генов, которые организованы в каскад. При этом все три рассмотренных выше гена - Small еye, Aniridia и eyeless – кодируют лишь факторы транскрипции; они находятся в начале каскада, т. е. только дают команду нa начало развития глаза, а остальные гены, функционирующие после них, уже определяют, какой глаз будет сформирован.