4.2. Репарация неспаренных оснований

Как мы уже говорили, во время репликации ДНК – полимераза допускает ошибки, в результате которых в дочернюю цепь ДНК оказываются включенными нуклеотиды, не комплементарные нуклеотидам в материнской нити (их называют мисмэтчами — от англ. mismatch). Такие ошибки корректируются с помощью мисмэтч – системы репарации. У Е. coli в этот процесс вовлечены продукты трех генов: mutS, mutL и mutH (рис. 8.14). Мутации по всем этим генам приводят к увеличению частоты спонтанных мутаций у Е. coli на 2-5 порядков.

Ясно, что неправильное спаривание (ошибка репликации) может затронуть только дочернюю нить ДНК, матричная нить в процессе репликации остается неизменной. Следовательно, система репарации мисмэтчей должна оперировать на дочерней цепи и производить замену некомплементарных оснований только в ней. Kлетки при этом используют важное различие в структуре матричной и дочерней нитей, найденное в 70-х гг. Оказалось, что вскоре после окончания репликации специальные ферменты метилазы присоединяют метильные группы к аденинам в последовательностях GАТС. Поэтому во время следующего цикла репликации нити ДНК оказываются различимыми: материнская нить несет метилированные аденины, а дочерняя – нет.

Пока они остаются неметилированными, клетки должны успеть отрепарировать мисмэтчи.

Процесс начинается с того, что к некомплементарной паре мисмэтча присоединяется белок MutS. С ним тут же связываются белок MutL и две молекулы белка MutH. Белок MutH распознает участок GATC и обладает эндонуклеазной активностью, с помощью которой ДНК в этой последовательности может быть надрезана вблизи аденина в неметилированной нити. Надрезы могут быть внесены как в 5'-, так и в З'-положение относительно аденина. Мультимолекулярный комплекс, составленный из этих белков, массивен и связывает длинный фрагмент ДНК. Последний протягивается через комплекс до следующего участка GATC, расположенного по другую сторону от мисмэтча. Иногда расстояние между участками GATC может превышать несколько тысяч нуклеотидов.

Благодаря своей эндонуклеазной активности MutH разрезает дочернюю нить в участке GATC. Затем к комплексу присоединяется еще один белок — экзонуклеаза, которая разрушает всю дочернюю нить до места неправильного спаривания и даже несколько дальше. Затем бреши застраиваются ДНК-полимеразой, а концы воссоединяются с помощью лигазы.

4.3. Пострепликативная репарация

Этот способ восстановления целостности ДНК заключается в репарации пробелов, образующихся в дочерних цепях напротив неудаленных до репликации димеров пиримидинов. Основная часть таких пробелов репарируется путем рекомбинационных обменов между двумя материнскими молекулами ДНК. В клетках этот процесс контролируется по крайней мере 17 генами.

Из комплементарной нити сестринской двойной спирали (она была свободна от дефектов), на которой репликация уже завершена, с помощью белка RecA вырезается участок ДНК, равный по длине участку бреши, и встраивается в брешь. Затем лигазы соединяют концы вставленного фрагмента с концами нормально синтезированного участка дочерней нити.

После этого другие ферменты репарации устраняют димер в исходно поврежденной нити, и ДНК становится «залеченной». Одновременно брешь, оставшаяся после вырезания участка из материнской нити, застраивается ДНК – полимеразой I и концы соединяются лигазой.

4.4. SOS - репарация

Что случится, если клетка подошла к моменту, когда нужно реплицировать ДНК, но в ней остались повреждения, которые ни одна из описанных выше систем репарации не смогла устранить? Репликация застопорится на первом жe неустраненном повреждении, и если их в ДНК много, клетка должна погибнуть. В этих условиях в клетках активируется еще один кpaйне рискованный механизм репapации, обнаруженный впервые в 1974 г. М. Радманом.

Большая доза УФ – света индуцирует повреждение ДНК (образование Т – Т димера), а также синтез RecA - копротеазы, которая разрезает белок LexA – репрессор оперона umuD, C. В результате синтезируются белки UmuD и UmuC, они вступают в комплекс с ДНК – полимеразой и RecA, который способен завершить остановившуюся репликацию на поврежденной матрице. При этом напротив повреждений в дочернюю цепь ставятся любые случайные нуклеотиды.

В результате SOS-репарации клетка спасается на этом этапе: ее ДНК оказывается удвоенной, хотя и с ошибкой, и теперь может произойти клеточное деление. Но если из-за этой ошибки жизненно важные функции клетки все-таки пострадают, такая клетка позже все равно погибнет.

С дефектами систем репарации связаны некоторые наследственные болезни человека.

В 1968 г. Дж. Кливер нашел, что причиной неизлечимой болезни пигментной ксеродермии являются дефекты разных репарирующих систем. У носителей болезни под действием обычного солнечного света, в котором всегда присутствуют УФ-лучи, на коже возникают красные пятна, которые постепенно переходят в незарастающую коросту, которая затем трансформируется в раковые опухоли.

В настоящее время известно, что многие другие наследственные болезни человека связаны с повреждениями процессов репарации.

Если в клетке, несмотря на осуществляемую репарацию, количество повреждений структуры ДНК остается высоким, в ней блокируются процессы репликации ДНК. Такая клетка не делится, а значит, не передает возникших изменений потомству.

Вызываемая повреждениями ДНК остановка клеточного цикла в сочетании с невозможностью молекулярной репарации измененного наследственного материала может с участием белка, синтез которого контролируется геном р53, приводить к активации процесса самоликвидации (апоптоз) дефектной клетки с целью устранения ее из организма.

Таким образом, обширный набор различных ферментов репарации осуществляет непрерывный «осмотр» ДНК, удаляя из нее поврежденные участки и способствуя поддержанию стабильности наследственного материала. Совместное действие ферментов репликации (ДНК-полимераза и редактирующая экзонуклеаза) и ферментов репарации обеспечивает достаточно низкую частоту ошибок в молекулах ДНК, которая поддерживается на уровне 1 · 10 ^-9 пар измененных нуклеотидов на геном. При размере генома человека 3 · 10⁹ нуклеотидных пар это означает появление около 3 ошибок на реплицирующийся геном. Вместе с тем даже этот уровень достаточен для образования за время существования жизни на Земле значительного генетического разнообразия в виде генных мутаций.