2.7.2. Пектиновые вещества и методы их определения

В древесине в срединной пластинке пектиновые вещества присутствуют преимущественно в нерастворимой форме, т. е. в виде протопектина. В состав комплекса протопектина входят галактуронаны (пектиновая кислота, рамногалактуронаны), арабинаны и галактаны, частично связанные между собой хи- мическими связями. Нерастворимость протопектина в воде обусловлена образованием карбоксильными группами галакту- ронанов солей кальция и магния, с возникновением поперечных мостиков между цепями. Поэтому для извлечения пектиновых веществ из древесины вместо экстрагирования водой применяют обработку горячими растворами оксалата или цитрата аммония,

приводящую к разрушению этих мостиков в результате обменной реакции с образованием нерастворимых солей — оксалатов или цитратов кальция и магния.

Для количественного определения полиуронидной части пектиновых веществ можно использовать гравиметрический кальций-пектатный метод, основанный на гидролизе сложно- эфирных групп пектиновой кислоты (групп метиловых эфиров) под действием гидроксида натрия, в результате чего пектиновая кислота превращается в полигалактуроновую кислоту, назы- ваемую пектовой кислотой, с последующим осаждением из раствора пектата кальция [28].

Кальций-пектатный метод имеет ряд недостатков [20]: не- полное осаждение полиуроновых кислот при одновременном осаждении нейтральных полисахаридов; невозможность опреде- ления всех составляющих комплекса пектиновых веществ, т. е. не только его полиуронидной, но и нейтральной части; большая длительность анализа.

Для одновременного количественного определения массовой доли в древесине и состава пектиновых веществ предложен спектрофотометрический метод, позволяющий с помощью о-толуидинового реагента определять полиуроновые кислоты (галактуронаны), гексозаны и пентозаны непосредственно в растворе без осаждения [20]. Метод основан на извлечении пектиновых веществ раствором цитрата аммония с последую- щим гидролизом полиуронидов и полисахаридов серной кисло- той и определением образовавшихся моносахаридов (пентоз, гексоз) и галактуроновой кислоты с о-толуидиновым реагентом. Образующиеся окрашенные соединения определяют спектро- фотометрическим методом. В работе [20] установлены опти- мальные условия анализа (извлечения пектиновых веществ и их гидролиза), которые и приводятся в изложенной ниже ме- тодике (см. 2.7.3). Для нахождения моносахаридного состава нейтральных полисахаридов комплекса пектиновых веществ можно использовать хроматографический анализ (см. 2.8.7).

2.7.3. Определение пектиновых веществ спектрофотометрическим методом

с о-толуидиновым реагентом

Методика анализа. Навеску измельченной древесины или другого растительного сырья (после обессмоливания этиловым эфиром или спиртотолуольной смесью) массой около 1 г поме- щают в грушевидную колбу вместимостью 100 см³, до- бавляют 40 см³ 1%-ного раствора цитрата аммония и ки-

пятят с обратным холодильником на электрической плитке в течение 1 ч. Полученный раствор отфильтровывают горячим через конусообразную стеклянную воронку с бумажным фильт- ром (или через стеклянный пористый фильтр) в мерную колбу на 100 см³. Попавшие на фильтр частицы древесины смывают новой порцией (40 см³) 1%-ного раствора цитрата аммония и повторяют обработку. Остаток древесины в колбе и на фильтре промывают небольшим объемом горячей дистиллированной воды и присоединяют промывные воды к раствору в мерной колбе. После охлаждения колбы с раствором до 20°С его объем доводят до метки (100см³) дистиллированной водой.

Для проведения гидролиза полиуронидов и полисахаридов отбирают пипеткой 5 см³ раствора пектиновых веществ в кругло- донную колбу вместимостью 25 см³, добавляют пипеткой 5 см³ раствора серной кислоты концентрацией (1/2 H₂SO₄) 4 моль/дм³, вносят стеклянные «кипятильники» (запаянные с одного конца кусочки капиллярной трубки) и кипятят с обратным холодиль- ником на электрической плитке в течение 3 ч. Гидролизат ох- лаждают до комнатной температуры и нейтрализуют равным объемом (10 см³) раствора карбоната натрия концентрацией (l/2Na₂CO₃) 2 моль/дм³. Нейтрализацию из-за сильного вспени- вания проводят в высокой пробирке (или цилиндре). Можно нейтрализовать не весь, а только часть гидролизата, достаточную для последующего анализа (например, к 2 см³ гидролизата добавляют 2 см³ раствора карбоната натрия).

Для проведения анализа углеводных компонентов в про- бирку с конусом типа П4 вместимостью 10 см³ пипеткой вносят 0,5 см³ нейтрализованного гидролизата, добавляют пипеткой 4 см³ о-толуидинового реагента (ОТР) и перемешивают со- держимое. Параллельно в другой пробирке готовят раствор сравнения (0,5 см³ дистиллированной воды и 4 см³ ОТР). Обе пробирки нагревают на кипящей водяной бане в течение 30 мин. Затем пробирки охлаждают до комнатной температуры, переливают растворы в кюветы с толщиной слоя 1 см³ и на спектрофотометре измеряют оптические плотности раствора при аналитических длинах волн 365, 385 и 630 нм, используя в качестве раствора сравнения смесь воды и ОТР. В такой же кювете измеряют оптическую плотность контрольного раство- ра — нейтрализованного гидролизата, разбавленного в 9 раз для учета разбавления при анализе с ОТР (с этой целью к 0,5 см³ нейтрализованного гидролизата добавляют 4 см³ дистиллиро- ванной воды) при длинах волн 365 и 385 нм, используя в качестве раствора сравнения дистиллированную воду.

Р ис. 2.9. Градуировочные графики для определения галактуроновой кислоты, пентоз и гексоз спектрофотометриче- ским методом с о-толуидиновым реа- гентом:

1 — ксилоза при 385 им; 2 — ксилоза при 365 им; 3 — глюкоза при 385 нм; 4 — галак- туроновая кислота при 365 нм; 5 — глюкоза при 365 нм; 6 — глюкоза при 630 нм; 7 — галактуроновая кислота при 385 нм

Для расчета коэффициен- тов поглощения строят градуи- ровочные графики для ис- пользуемого спектрофотометра по растворам чистых сахаров (рис. 2.9).

При расчете концентраций в исследуемом растворе галак- туроновой кислоты, пентоз и гексоз используют значения оптической плотности при 365, 385 и 630 нм за вычетом значений оптической плотности контрольного раствора. Сна- чала находят концентрацию гексоз по оптической плот- ности при 630 нм, пользуясь коэффициентом поглощения, который определяют по градуировочному графику, построен- ному по чистой глюкозе (см. рис. 2.9, прямая 6). Затем для расчета концентраций галактуроновой. кислоты и пентоз из значений оптической плотности исследуемого раствора, из- меренных при длинах волн 365 и 385 нм, вычитают значения оптической плотности, обусловленные поглощением гексоз. Последние определяют по найденной концентрации гексоз, пользуясь градуировочными графиками, построенными для этих длин волн по чистой глюкозе (см. рис. 2.9, соответ- ственно прямые 5 и 3). При дальнейшем расчете концентра- ций галактуроновой кислоты и пентоз используют уравнения Фирордта для количественного спектрофотометрического ана- лиза многокомпонентных систем. Коэффициенты для этих уравнений рассчитывают с помощью градуировочных гра- фиков, построенных для длин волн 365 и 385 нм по чистым галактуроновой кислоте и ксилозе (рис. 2.9, прямые 4, 7, 2, 1).

Вывод уравнений и расчет коэффициентов. В применении к анализируемому раствору сахаров уравнения Фирордта будут иметь вид

где D₃₆₅ и D₃₈₅ - оптические плотности анализируемого раствора

при длинах волн 365 и 385 нм за вычетом поглощения гексоз; с₁ и с₂ — концентрации соответственно пентоз и галактуроновой кислоты, мкг/см³; . — коэффициенты погло- щения продуктов реакции с ОТР пентоз и галактуроновой кислоты при длинах волн 365 и 385 нм; d — толщина кюветы, см, d= 1 см.

Решая систему двух уравнений, получают уравнения для расчета концентрации, мкг/см³, пентоз

и галактуроновой кислоты

где соответствующие коэффициенты (при d=l см) будут равны

Расчет массовой доли пектиновых веществ. После расчета концентрацией, мкг/см³, галактуроновой кислоты с₂(С_галу), пентоз с₁(с_пентоз) и гексоз (с_гексоз). рассчитывают массы полисахаридов и полиуронидов с учетом общего объема раствора (100 см³) пектиновых веществ, разбавлений n при гидролизе (n=2) и нейтрализации (n=2) и коэффициентов пересчета моносахаридов в полисахариды (соответственно, для гексуроновых кислот 0,907, пентоз 0,88 и гексоз 0,90):

Затем рассчитывают общую массу пектиновых веществ как сумму масс всех полисахаридов и полиуронидов

Массовую долю пектиновых веществ Х_пв, % к исходной (необессмоленной) абсолютно сухой древесине, рассчитывают по формуле

где m_пв — масса пектиновых веществ, г; g — масса абсолютно сухой навески обессмоленной древесины, г; Кэ — коэффициент экстрагирования органическим растворителем (см. 2.4.1).

Приготовление о-толуидинового реагента (ОТР). Смеши- вают 150 см³ ледяной уксусной кислоты, 60 см³ свежеперегнанного над цинковой пылью о-толуидина, 50 г лимонной кислоты, 0,75 г тиокарбамида и 5 г ортоборной кислоты в мерной колбе на 500 см³, доводят дистиллирован- ной водой до метки и хранят в темной посуде в холодильнике (при 0°С).

Построение градуировочных графиков. Готовят по пять растворов чистых сахаров (галактуроновой кислоты, ксилозы и глюкозы) концентрацией 40, 80, 120, 160 и 200 мкг/см³. Каж- дый раствор обрабатывают ОТР в условиях определения пектиновых веществ и измеряют оптические плотности при 365 и 385 нм, а для растворов глюкозы — дополнительно при 630 нм и строят соответствующие графики, откладывая по оси абсцисс концентрации растворов, мкг/см³, а по оси ординат — значения оптической плотности D (см. рис. 2.9).

2.8. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЛЕГКО- И ТРУДНОГИДРОЛИЗУЕМЫХ ПОЛИСАХАРИДОВ

Определение легко- и трудногидролизуемых полисахаридов в древесине основано на реакциях их гидролиза (см. 2.1.1) с последующим нахождением общего количества образовав- шихся моносахаридов по редуцирующей (восстанавливающей) способности. Для определения содержания отдельных моно- сахаридов в гидролизатах — гексоз и пентоз — используют хро- матографический анализ.

Легко- и трудногидролизуемые полисахариды разделяют, используя различные условия гидролиза. Для гидролиза легко- гидролизуемых полисахаридов применяют обработку древесины разбавленными минеральными кислотами (обычно 2. ..5% -ной соляной кислотой или 5...10%-ной серной кислотой при темпе- ратуре около 100°С), а для гидролиза трудногидролизуемых полисахаридов — обработку концентрированной кислотой (72...80%-ной серной кислотой) при температуре 20...25°С (иногда ниже) [28, 30]. Для полного гидролиза полисахаридов

древесины вместо серной кислоты можно использовать три- фторуксусную кислоту [24].

Гидролиз полисахаридов разбавленной кислотой идет в гетерогенной среде, а гидролиз концентрированной кислотой — в гомогенной. В концентрированной кислоте полисахариды сначала набухают и растворяются, а затем уже происходит их гидролитическая деструкция. Однако в связи с недостат- ком воды в реакционной смеси продуктами гидролиза в кон- центрированной ки-слоте являются не моносахариды, а олиго- сахариды. Они образуются, во-первых, при частичном гидролизе полисахаридов, а во-вторых, в результате реверсии моноса- харидов — реакции обратной гидролизу. Для доведения гидро- лиза до конечной стадии — получения моносахаридов — про- водят дополнительный гидролиз — инверсию. Раствор олиго- сахаридов в концентрированной кислоте разбавляют (обычно до массовой доли кислоты в растворе 3...4%) и кипя- тят в течение 3...5 ч. При анализе малоизученного сырья рекомендуется проводить предварительные опыты для установ- ления необходимой продолжительности стадии дополнительного гидролиза до достижения максимального выхода моносаха- ридов. При слишком длительной стадии дополнительного гидролиза начинается распад моносахаридов, а также проис- ходит реакция реверсии.