2.3. Коэффициенты подвижности моносахаридов

Моиосахарид	Этилацетат — пиридин — вода (5:1:5)			Бутанол — Уксусная Кислота – вода (4:1:5)			Бутанол - ацетон — вода (4:5:1)
	Rf		Rкс	Rf	Rкс		Rf	Rкс
Галактоза	0,15	0,45		0.16		0,57	0,22		0,42
Глюкоза	0,18	0,56		0,18		0,65	0,30		0,58
Манноза	0,22	0,66		0,20		0,72	0,32		0,61
Фруктоза	0,23	0,72		0,23		0,82	0,40		0,77
Арабиноза	0,25	0,76		0,24		0,86	0,44		0,86
Ксилоза	0,33	1,00		0,28		1,00	0,52		1,00
Рамноза	0,47	1,46		0,37		1,32	0,68		1,31

Примечание. Смесь бутанол — уксусная кислота — вода используют для восходящей хроматографии.

Подготовка гидролизата. Концентрация РВ в гидроли- зате, подготовленном для хроматографирования, должна нахо- диться в пределах 1...3%. При необходимости гидролизат упаривают. Упаривание проводят в вакуум-сушильном шкафу при температуре 50...60°С или при нагревании на водяной бане в фарфоровой чашке или в стеклянном стакане. Гидро- лизат легкогидролизуемых полисахаридов предварительно нейтрализуют концентрированным раствором гидроксида натрия до слабощелочной реакции и подкисляют концентрированной уксусной кислотой до рН 5 (по универсальной индикаторной бумаге), затем упаривают и фильтруют через простую конусо- образную воронку с бумажным фильтром. Гидролизат трудно- гидролизуемых полисахаридов нейтрализуют карбонатом бария и отфильтровывают осадок сульфата бария. Полученный фильт- рат сразу подвергают хроматографированию (при хранении ней- трализованного раствора содержание в нем моносахаридов по- нижается). При необходимости производят упаривание после подкисления уксусной кислотой до рН 5 и снова фильтруют. Кратность упаривания точно определяют и учитывают при расчете масс моносахаридов.

Приготовление растворителя. Для приготовления смеси этилацетат — пиридин — вода (5:1:5) 150 см³ этилацетата и 30 см³ пиридина хорошо взбалтывают в делительной во- ронке вместимостью 500 см³, затем прибавляют к смеси 150 см³ дистиллированной воды и снова хорошо взбалтывают в течение 2...3 мин. После этого смесь оставляют для расслаивания. Когда верхний слой жидкости станет прозрачным, нижний слой сливают, а верхний используют для хроматографирования. По- добным образом готовят и другие составы растворителей,

смешивая органические растворители и воду в соответствую- щих пропорциях.

Хроматографическое разделение. Установка для хроматографирования представляет собой широкий цилиндр с притертой крышкой. Внутрь цилиндра помещают малый ци- линдр, на который ставят чашку с растворителем (рис. 2.11).

Нарезают (вдоль волокон) 10...12 полосок хроматографи- ческой бумаги размером 3X45 см. При хроматографировании нижний конец полоски может свободно свисать либо его вы- резают в виде «язычка», который вставляют в горлышко кол-

бочки-приемника. На расстоянии 10...15 см от другого конца полоски отмечают точку старта, на которую наносят определен- ное количество подготовленного гидролизата. Все отметки, на бумажной полоске делают только графитовым карандашом.

Пробу гидролизата (0,03 см³ при массовой доле РВ 1%) наносят микропипеткой со специальным приспособлением (рис. 2.12), состоящим из резиновой груши в металлическом кожухе и микровинта с шариком. Если упаривание гидролизата нежелательно, то на бумагу наносят несколько раз в одно и то же место (по 0,01 см³) необходимый объем раствора сахара, который рассчитывают исходя из массовой доли РВ. После нанесения каждой порции раствора пятно хорошо просушивают (лучше всего горячим воздухом). Диаметр нанесенного пятна не должен превышать 5...6 мм.

Полоски устанавливают в строго вертикальном положении. Конец полоски, на который нанесена проба, загибают в чашку. Пятно пробы должно находиться снаружи чашки ниже ее края не менее чем на 2 см. Второй конец вставляют в

колбочку-приемник (либо оставляют свисающим). Для лучшей идентификации сахаров в установку помещают также полоску бумаги с нанесенным раствором смеси чистых моносахаридов: галактозы, глюкозы, маннозы, арабинозы, ксилозы. В чашку на- ливают растворитель и установку герметично закрывают крышкой.

Хроматографирование проводят при температуре 18...22°С, помещая установку в специальную комнату или шкаф. Разде- ление осуществляется за 24...90 ч (в зависимости от качества бумаги и температуры среды). Хроматографирование считают законченным тогда, когда на проявленной хроматограмме рас- стояния между пятнами будут не менее 3 мм.

После окончания разделения сахаров хроматограммы сушат на воздухе (в вытяжном шкафу) в течение примерно 4 ч до полного удаления растворителя. При сушке хроматограммы перекидывают через стеклянную палочку, укрепленную на двух штативах.

Проявление хроматограмм. Проявителем служит раствор, содержащий 1,66 г фталевой кислоты и 0,92 см³ свежеперегнанного анилина в 100 см³ этанола.

Сухие хроматограммы смачивают равномерно проявителем кратковременным погружением в раствор, отжимают между листами фильтровальной бумаги и немного подсушивают на воздухе. Затем хроматограммы помещают в сушильный шкаф, предварительно нагретый до нужной температуры. Несколько хроматограмм одновременно кладут на ребро так, чтобы они не касались друг друга и стенок шкафа. Проявление ведут при температуре 100...105°С в течение 5 мин (или при 80°С в те- чение 30 мин). Аналогичным образом проявляют полоски бумаги с нанесенным раствором смеси чистых сахаров. При установле- нии природы сахаров руководствуются цветом пятен, их отно- сительным расположением и расположением пятен чистых са- харов.

Фотоколориметрическое определение сахаров. Из проявленной хроматограммы вырезают участки, соответ- ствующие отдельным сахарам (цветным пятнам), и разрезают их на узкие полоски. Помещают кусочки хроматограмм (каж- дое пятно в отдельности) в пробирки с пришлифованными пробками и заливают 8 см³ раствора HCl в этаноле. Элюи- рование ведут в течение 1 ч при комнатной температуре, поместив пробирки в темноту. Через каждые 5...10 мин пробир- ки энергично встряхивают.

Элюаты сливают в подготовленные сухие пробирки и фото- метрируют — измеряют оптическую плотность (интенсивность окраски) на фотоэлектрическом колориметре при синем свето-

фильтре в кювете толщиной 10 мм или же на спектрофото- метре при длине волны 420 нм.

Массу каждого моносахарида определяют по соответствую- щим градуировочным графикам. Зная массу сахара в пробе гидролизата, нанесенной на хроматограмме, объем этой пробы, кратность упаривания и общий объем гидролизата, рассчиты- вают массовую долю, % к абсолютно сухой древесине, соот- ветствующих полисахаридов П — глюканов, маннанов, галак- танов, ксиланов, арабинанов

где b — масса моносахарида в пробе гидролизата, мкг; v — объем пробы гидролизата, взятый на хроматографирование, см³; V — общий объем гидролизата, V=500 или 200 см³; k — коэффициент пересчета моносахаридов на полисахариды, k = 0,90 для гексозанов и 0,88 для пентозанов; n — кратность упаривания (если нейтрализованный гидролизат не упаривали, n=1); g — масса абсолютно сухой навески древесины, г.

Построение градуировочных графиков. Градуировочный график для каждого моносахарида представляет собой за- висимость оптической плотности элюата от массы сахара на хроматограмме (в микрограммах). Для построения графиков готовят точно 1%-ные растворы чистых моносахаридов. На полоску хроматографической бумаги на расстоянии 3....4 см друг от друга наносят разные количества 1%-ного раствора сахара: 0,01; 0,02; 0,03; 0,04 и 0,05 см³ (наносят по 0,01 см³ в одно и то же место после подсушивания). После высыхания пятен полоску проявляют раствором анилинфталата в этаноле в точно таких же условиях, как и при анализе гидролизатов. Проводят элюирование и фотометрирование, как описано выше. На осно- вании средних данных нескольких параллельных определений (пять-шесть) для каждого моносахарида строят градуировочный график. Иногда градуировочный график для глюкозы исполь- зуют для всех гексоз, а график для ксилозы — для всех пентоз. Последний способ менее точен.

Примечания:

1. Для хранения в течение некоторого времени стандартные растворы чистых моносахаридов и раствор смеси моносаха- ридов готовят в 0,5%-ном растворе HCI.

2. Для приготовления элюирующего раствора соляной кис- лоты в этаноле вливают 29 см³ 36%-ной HCI в 420 см³ 95%-ного этанола и доводят раствор в мерной колбе дистиллированной водой до объема 500 см³.