1.1.2. Микроскопическое исследование срезов древесины
Для микроскопического изучения строения древесины поль- зуются тремя срезами в трех взаимно перпендикулярных пло- скостях: поперечным и двумя продольными — радиаль- ным (в плоскости радиуса, под прямым углом к границам
годичных слоев) и тангенциальным, параллельным каса- тельной окружности дерева (рис. 1.1).
Древесина как хвойных, так и лиственных пород на попе- речном сечении состоит из концентрических годичных слоев (годичных колец). Эти слои можно различать благодаря обра- зованию ранней (весенней) и поздней (осенней) древе- сины. Ранняя древесина менее плотная и более темная. Го- дичные слои хорошо различимы в древесине хвойных и кольце- сосудистых лиственных пород и мало заметны у рассеянно- сосудистых. Ширина годичного слоя составляет от 1 до 10 мм
и зависит от породы деревьев и условий роста: чем лучше условия роста, тем шире годичный слой. На радиальном срезе также можно заметить годичные слои, а на тангенциальном они отсутствуют, так как разрез может пройти только в ка- кой-то одной части годичного слоя — в ранней или поздней древесине.
Микроскопическое исследование срезов древесины [16] поз- воляет изучать ее анатомические элементы (механические волокна, проводящие элементы, сердцевинные лучи и др.). Отдельные анатомические элементы и их диагностические приз- наки изучают также используя метод мацерации древесной ткани.
1.1.3. Подготовка препаратов и работа с микроскопом
Для приготовления препаратов к исследованию в микроско- пе необходимы предметные и покровные стекла, препаровальные иглы, копьецо, стеклянные капельницы, чашки Петри, кристал- лизаторы, ситечки и фильтровальная бумага. Предметные стекла—стеклянные пластинки прямоугольной формы размером 75X25 мм, толщиной 1...1.2 мм. Покровные стекла — тонкие стеклянные пластиночки размером 18Х'8, 20X20 мм. Предмет- ные и покровные стекла должны быть чистыми, перед употреб- лением их протирают кусочком мягкой ткани, хранят в спе- циальных коробочках.
Подготовка срезов. Изготовление срезов древесины прово- дят вручную остро отточенной бритвой или на специальных приборах — микротомах и ультрамикротомах. Первый метод, хотя и имеет большую давность, не потерял своего значения до настоящего времени. Основные его преимущества перед работой на микротомах — это быстрота и простота в приготов- лении среза.
Получение срезов древесины на микро- или ультрамикротоме требует сложных методов фиксации и резки материала.. Подго- товка срезов состоит в последовательном проведении следующих операций: обезвоживания; пропитки; полимеризации; заточки блока; изготовления ножа; резки; освобождения от полимериза- та; окраски; промывки; фиксации. Этот метод используют глав- ным образом для приготовления ультратонких срезов для элект- ронной микроскопии [1].
Толщина изготовляемых срезов для оптической микроскопии должна быть в среднем 0,02...0,03 мм. Для более точных исследований — до 0,0005 мм.
Методика подготовки срезов вручную [3]. Для изготовления срезов древесины вручную применяют опасную бритву, имеющую одну совершенно плоскую сторону, без выемки или лезвия безопасной бритвы. Исследуемый обра- зец древесины цилиндрической или прямоугольной формы вырезают из кусочка ствола острым ножом или скальпелем. Перед резкой образец древесины кипятят в течение 30 мин, а иногда и нескольких часов в воде с последующим переносом его в холодную воду или остыванием в том же сосуде, в ко- тором проводилось кипячение. Это необходимо для удаления из древесины пузырьков воздуха и получения образца с определен- ной твердостью. Свежесрубленная древесина в большинстве случаев режется без всякой подготовки, но при этом ее не- обходимо держать в воде. Фиксированные образцы (выдержан- ные длительное время в этаноле, формалине или других реаген-
тах) тщательно промывают водой в течение некоторого времени, чтобы удалить фиксирующий материал.
Образец мокрой древесины помещают между двумя кусочка- ми пробки или бузины и для образования ровной поверхности срезают древесину острым ножом. Затем поверхность древесины смачивают водой и осторожно с нее снимают бритвой слои вместе с пробкой. Бритву также все время смачивают водой или спиртом, держат наискось, плоской стороной вниз, острием от себя и протягивают через объект скользящим движением, сво- бодно и легко. Нельзя при этом прижимать локти к туловищу или опираться ими на стол, так как это лишит руки свободы движения. Если бритва врезалась в древесину слишком глубоко, лучше вынуть ее во избежание поломки. Срезы должны полу- чаться очень маленькими (1 ... 2 мм2) и совсем прозрачными. Полученные срезы снимают с лезвия очень осторожно мягкой кисточкой, переложив бритву в левую руку и не выпуская объект. Для проверки качества срезы переносят в заранее приготовленную каплю воды на предметном стекле и просматри- вают при малом увеличении микроскопа. Если срезы плохие, то их выбрасывают и делают новые.
Следует отметить, что приготовление срезов вручную требует известного навыка и умения владения опасной бритвой, чтобы получить с ее помощью удовлетворительные срезы. Необходимо бережно обращаться с бритвой, постоянно точить и править ее, оберегать от ударов и реактивов, держать сухой и закрытой.
Подготовка препаратов. Из полученных срезов готовят вре- менные или постоянные препараты. Изучать древесину и цел- люлозные материалы с помощью микроскопа через воздушную прослойку нецелесообразно, так как вследствие отражения лучей света от боковых частей материала его контуры будут видны очерченными слишком темными линиями. Поэтому ис- следуемый материал заключают в какую-либо жидкость, которая уменьшает отражение лучей и увеличивает прозрачность. Для более контрастного выявления особенностей строения анатомических элементов на срезах древесины до заключения их в ту или иную среду проводят окрашивание. Наиболее часто для окраски применяют 1%-ный водный раствор сафранина или комбинацию красителей: сафранин и водный синий; хризоидин и водный синий либо светлый зеленый. Срезы помещают в ванночку с красителем и выдерживают в нем в течение 5 мин, затем избыток красителя отмывают водой, глицерином или спиртом.
Приготовление временных препаратов. Каплю воды наносят пипеткой или стеклянной палочкой на середину
чистого сухого предметного стекла, препаровальными иглами пе- реносят в нее срез и накрывают покровным стеклом. Покровное стекло прикладывают к предметному под острым углом так, чтобы оно касалось края капли; после этого его осторожно опускают. Капли жидкости, выступающие по краям покровного стекла, удаляют слегка смоченной фильтровальной бумагой, подводя ее к одному краю покровного стекла. Если жидкости под стеклом мало, ее добавляют, приподняв покровное стекло, или наносят каплю воды вплотную к краю покровного стекла. При резком опускании покровного стекла в жидкости остаются пузырьки воздуха, заметные под микроскопом, в виде черных резко очерченных кружков, которые мешают изучению объекта в микроскопе.
Временные препараты могут быть использованы для исследо- ваний только на одном занятии. Долго сохранять их не- возможно, так как вода быстро испаряется.
Приготовление постоянных препаратов. Для сохранения препарата в течение длительного времени окра- шенные срезы древесины заключают не в воду, а в глицерин- желатиновую смесь или в пихтовый (канадский) бальзам. Перед заделкой срезы обезвоживают.
В. случае приготовления глицерин-желатиновых препаратов воду и избыток красителя из срезов удаляют тщательной промывкой глицерином с его отсасыванием. Эту операцию можно проводить на воронке фильтрующей обратной (с пори- стой стеклянной пластинкой) типа ВФОТ диаметром 10...20 мм. После этого срезы заключают в глицерин-желатину.
Для приготовления глицерин-желатины взвешивают 10 г сухой желатины, помещают в стакан и заливают 60 см3 дистиллированной воды. После набу- хания прибавляют 70 см3 чистого глицерина и несколько кристалликов фенола. Смесь подогревают на водяной бане до полного перемешивания веществ. Если смесь остается мутной, ее фильтруют в горячем виде через стеклянную конусообразную воронку с бумажным фильтром. Глицерин- желатину можно хранить в пробирке или колбе, закрытых пробкой с пропу- щенной через нее стеклянной палочкой. Перед употреблением глицерин- желатину нагревают на водяной бане до расплавления.
Глицерин-желатину (одну-две капли) стеклянной палочкой наносят на срез, предварительно помещенный на предметное стекло. Чтобы глицерин-желатина сразу не застыла на холодном предметном стекле, его слегка подогревают на спиртовке. На теплую каплю накладывают покровное стекло, также прогретое на пламени спиртовки, и кончиком иглы осторожно придавли- вают стекло, равномерно распределяя глицерин-желатину. Когда среда остынет, края покровного стекла можно обвести лаком,
чтобы предотвратить высыхание желатины. Этот способ при- готовления препаратов достаточно простой, но срезы со време- нем обесцвечиваются.
Для заключения среза в бальзам процесс обезвоживания осуществляется значительно сложнее, так как ксилол, в котором растворен бальзам, совершенно не смешивается с водой. Вода (даже малейшие следы), оставшаяся в срезе, образует муть (эмульсию). Обезвоживание проводят водным этанолом восхо- дящей концентрации: 40%-ным в течение I мин; 70 и 96%-ны- ми — по 2 мин. Для удаления последних следов воды срез об- рабатывают двумя каплями фенол-ксилола (ксилол с прибавле- нием 5.-.10% кристаллического фенола) в течение 2...3 мин и после просветления для удаления фенола срез промывают в чистом ксилоле.
Для заключения препарата в бальзам одну-две капли его раствора в ксилоле наносят стеклянной палочкой на срез и накладывают покровное стекло. Слегка надавливая на покровное стекло препаровальной иглой, удаляют из под него избыток бальзама и пузырьки воздуха. Выступивший вокруг покровного стекла бальзам удаляют нагретым копьецом или перочинным ножом. Через несколько дней бальзам у краев стекла под- сохнет и препарат может быть окончательно вычищен бензином. Все операции по заключению в бальзам и глицерин-желатину могут быть проведены непосредственно на предметном стекле. Обычно на одно предметное стекло помещают рядом три среза: поперечный срез располагают слева, а продольные (радиальный и тангенциальный)—справа один под другим. За ходом об- работки следят при малом увеличении микроскопа или в штатив- ной лупе, не покрывая срезы покровным стеклом. Готовые постоянные препараты хранят в коробочках в вертикальном положении.
Методика мацерации древесной ткани. Мацерацию древесной ткани осуществляют разрушением межклеточного вещества в результате делигнификации сильными окислителями. Наиболее часто в качестве окислителей используют 10 или 20%-ные раст- воры хромовой кислоты или концентрированную азотную кисло- ту (плотностью 1,4 г/см') с добавлением небольшого количе- ства хлората калия (бертолетовой соли).
Мацерацию древесины азотной кислотой осуществляют сле- дующим образом: кусочек древесины толщиной в спичку и длиной 10...20 мм вырезают из той или иной части ствола дерева, помещают в пробирку, заливают 3...4 см3 концентри- рованной азотной кислоты и вносят кристаллик бертолетовой соли. Пробирку нагревают на небольшом пламени спиртовки при слабом кипении в течение 3...4 мин. Чтобы не произошло
выброса смеси, необходимо нагревание проводить осторожно по всей поверхности пробирки. Нагревание прекращают при первых признаках мацерации, т. е. при появлении в жидкости от- дельных волокон и их пучков. После охлаждения мацерирован- ную древесину промывают дистиллированной водой путем много- кратного декантирования. Из полученных мацерированных воло- кон готовят препараты по указанной выше методике и исследуют с помощью оптического микроскопа.
Работа с микроскопом. Перед работой с микроскопом необ- ходимо ознакомиться с инструкцией по его эксплуатации. Прис- тупая к работе с микроскопом, необходимо снять с него чехол, аккуратно протереть от пыли мягкой тканью, затем с помощью зеркала и источника света, глядя в окуляр, добиться яркого, равноосвещенного поля зрения.
Для получения отчетливого изображения предметное стекло с изучаемым объектом помещают на предметный столик и с помощью макрометрического винта перемещают зрительную трубу по высоте, пока объект не будет ясно виден. Далее посредством микрометрического винта микроскоп устанавливают таким образом, чтобы можно было рассмотреть препарат по всей его толщине.
При исследовании препаратов древесины необходимо рас- смотреть под микроскопом и зарисовать изображение всех трех срезов, отмечая при этом основные анатомические элементы (см. 1.1.4 и 1.1.5). Наблюдаемые срезы необходимо сравнить с микрофотографиями аналогичных образцов древесины в лите- ратуре (Оболенская А. В., Леонович А. А. Химия древесины.— Л.: ЛТА, 1989.—88 с.); [4] и др. В лаборатории по анатомии древесины должны также иметься соответствующие атласы и плакаты. По окончании работы следует убрать препарат, уда- лить пыль и следы жидкости с предметного столика и покрыть микроскоп чехлом.