4.8. Кинетические и биохимические методы анализа*

4.8.1. Кинетические методы

Первые работы, в которых содержание какого-либо вещества в растворе находили по скорости реакции, протекающей с участием этого вещества, появились в 30-х гг. XX века. В 50–60-х гг. была развита теория нового метода, разработаны и опубликованы сотни методик. Решающую роль в создании кинетических методов анализа сыграл советский ученый К.Б. Яцимирский. В настоящее время кинетические методы используются довольно часто, преимущественно при определении микрограммовых количеств тяжелых металлов и биологически активных органических веществ.

В отличие от классических методов химического анализа (гравиметрия, титриметрия и др.), в кинетических методах аналитический сигнал измеряют в динамических условиях, т. е. используют системы, движущиеся к равновесию. Кинетические методы основаны на зависимости ско­рости реакции mA + nB ↔ pC + qD, протекающей в растворе, от концентрации одного из реагентов. В случае, когда в реакции участвует катализатор, скорость реакции зависит и от концентрации катализатора:

, (4.52)

где k – константа скорости реакции; С_A, С_B и С_кат – текущие кон­центрации реагирующих веществ и катализатора соответственно; m и n – коэффициенты (в простейшем случае – стехиометрические коэффициенты m и n).

Реакцию, скорость которой зависит от концентрации определяемого вещества, называют ин­дикаторной. Скорость этой реакции в кинетических методах является аналитическим сигналом.

Скорость индикаторной реакции (v) рассчитывают по изменению концентрации одного из реагентов в единицу времени. Обычно начальные концентрации всех реагентов известны, поэтому для нахождения скорости достаточно определять текущую (меняющуюся во времени) концентрацию одного из них. Можно следить за уменьшением концентрации какого-либо из исходных веществ или за увеличением концентрации одного из продуктов реакции. Вещество, по изменению концентрации которого судят о скорости индикаторной реакции, называют индикаторным¹. Для наблюдения за изменением концентрации индикаторного веще­ства во времени, как правило, используют инструментальные методы. А именно: реагирующие вещества смешивают в подходящем сосуде и затем непрерывно или в определенные моменты времени измеряют какое-либо физическое свойство раствора, функционально связанное с концентрацией индикаторного вещества.

Индикаторная реакция должна отвечать определенным требованиям:

а) концентрация оп­ределяемого компонента не должна существенно изменяться за время наблюдения. Для катализатора это условие выполняется всегда, так как он не расходуется в процессе реакции. Если же определяемым является одно из реагирующих веществ, то с достаточной точностью его концентрацию можно определять в тот началь­ный период реакции, в течение которого его концентрация изменяется не более чем на 5 %;

б) необходимо наличие быстрого, простого и доступного метода наблюдения за скоростью инди­каторного процесса, т. е. за изменением концентрации индикаторного вещества во времени;

в) скорость индикаторной реакции должна находиться в определенных пределах. Обычно время наблюдения за скоростью индикаторного процесса составляет 5–15 мин. Очень медленные реак­ции использовать нецелесообразно, так как удлиняется время анализа; а для измерения скорости очень быстрых реакций требуются сложные и не очень точные методы. Следует, однако, отметить, что с развитием методов изучения быстрых процессов в качестве индикатор­ных стали использовать и реакции, протекающие в течение нескольких секунд.

Способы определения концентрации по кинетическим данным. Если текущую концентрацию индикаторного вещества – продукта реакции – обозначить через х, то скорость реакции можно выразить как

. (4.53)

Если концентрация хотя бы одного из реагирующих веществ за время наблюдения за скоростью реакции заметно (более чем на 10 %) изменяется, то между концентрацией индикаторного вещества и временем реакции существует довольно сложная (например, логарифмическая) зависи­мость. Ее можно использовать для расчета скорости реакции. Соответствующие варианты кинетических методов называют интегральными.

Если же за время наблюдения концентрации исходных реагентов А и В не успевают заметно измениться, их можно считать постоянными величинами. Тогда, проин­тегрировав уравнение (4.53), получим

= К t. (4.54)

Формула (4.54) показывает, что в начальный момент реакции концентрация индикаторного вещества (продукта реакции) возрастает во времени линейно. Тангенс угла наклона прямой в координатах x – t (tg ) прямо пропорционален скорости реакции. Кинетические методы, основанные на использовании уравнения (4.54), называют дифференциальными.

Существуют три основных способа определения неизвестной концен­трации одного из реагентов (например, вещества А) по данным кинетических измерений: способ тангенсов, способ фиксированного времени и способ фиксированной концентрации.

Способ тангенсов предусматривает построение серии кинетических кривых в координатах x – t. Каждая кривая отвечает некоторой концентрации аналита (рис. 4.16а). Прочие условия измерений одинаковы. Затем строят графическую зависимость величины tgα от концентрации определяемого вещества (градуировочный график). Определяют tgα для раствора пробы и находят концентрацию аналита по градуировочному графику.

Способ фиксированного времени заключается в том, что при строго фиксированном времени протекания реакции определяют концен­трацию образовавшегося за это время индикаторного вещества. Это делают несколько раз в присутствии проб, содержащих разные извест­ные концентрации определяемого соединения. Градуировочный график строят в координатах: концентрация индикатор­ного вещества при фиксирован­ном времени реакции – концентрация аналита (рис. 4.16б). Часто при рабо­те способом фиксирован­ного времени индикатор­ную реакцию останавли­вают через определен­ный промежуток време­ни резким изменением кислотности раствора, охлаждением, добавлением ве­щества-ингибитора или другим способом.

В способе фиксиро­ванной концентрации в присутствии различных проб, содер­жащих известные кон­центрации определяемого соединения, проводят ин­дикаторную реакцию до строго фиксированной концентрации индика­торного вещества, например, до полного обесцвечивания раствора. Градуировочный график строят в координатах величина, обратная времени достижения фиксированной концентрации, – концентрация определяемого соединения (рис. 4.16в). Все три описанных способа применимы для дифференциаль­ного варианта кинетических методов. В интегральном варианте спо­собы определения неизвестной концентрации вещества аналогичны, но более сложны. Наиболее часто в кинетических методах применяют способ танген­сов как наиболее точный и универсальный. Реже применяют способы фиксированного времени и фиксированной концентрации, хотя они более просты и менее трудоемки. При проведении серийных анализов все три способа могут быть использованы в автоматизированных вариантах.

Рис. 4.16. Способы определения концентрации по данным кинетических измерений: а — тангенсов; б — фиксированного времени; в — фиксированной концентрации

Как уже отмечалось, за изменением концентрации индикаторного ве­щества во времени можно наблюдать любым методом. На практике при построении кинетических кривых вместо концентрации образующегося продукта (х) обычно измеряют величину любого пропорционального ей параметра раствора – оп­тической плотности, силы тока, электропроводности и т. д. Чаще всего для наблюдения за скоростью индикаторного процесса используют спектрофотометрические и люминесцентные, реже – электрохимические, тер­мометрические и совсем редко – титриметрические методы.

Каталитические и некаталитические методы. В зависимости от того, какой компонент индикаторной реакции определяют, кинетические методы подразделяют на каталитические и некаталитические. Если определяется один из исходных реагентов, это – некаталитический вариант. Если же определяют катализатор или соединения, взаимодействующие с катализатором и изменяющие при этом его активность, то это каталитический вариант. Вещества, повышающие каталитическую активность катализатора, называются активаторами, а понижающие ее – ингибиторами. Следует отметить, что катализаторами химических процессов могут быть как неорганические (ионы металлов, анионы), так и органические (азот-, серо-, фосфорсодержащие) соединения. Аналитические возможности некаталитических и каталитических кинетических методов различны .

Некаталитические методы не отличаются высокой чувствительностью, но они селективны, позволяют опре­делять в смеси близкие по свойствам вещества без их предварительного разделения. Например, два сходных по химическим свойствам со­единения А и В реагируют с одним и тем же реагентом R, образуя продукты P₁ и Р₂ , но реакция с участием вещества А идет гораздо быстрее, имеет гораздо большую константу скорости (k₁ > k₂). Для того чтобы определить один из компонентов в смеси с достаточной точно­стью, необходимо относительно большое различие в константах скорости реакций этих компонентов с одним и тем же реагентом. Добиться этого можно, изменяя рН или температуру системы, подбирая соответствующие растворители и т. д. Если k₁/k₂ > 500, то в начальный период реакции возможно определять вещество А на фоне вещества В с погрешностью < 1 %. Если же константы скорости реакций взаимодействия с реагентом близких по свойствам компонен­тов смеси мало отличаются друг от друга, а увеличить разли­чие до предела, позволяющего пренебречь одной из реакций, не удается, используют специальные расчетные методы. Так, еще в 1930 г. в США был предложен остроумный и достаточно точный способ раздельного определения изомеров бутена, основанный на различной скорости взаимодействия продуктов их бромирования с KI. Не­каталитические кинетические методы применяют для анализа смесей органических соединений (спиртов, сахаров, аминов), а также для анализа смесей близких по свойствам ионов металлов (щелочноземель­ные или редкоземельные элементы).

Каталитические методы анализа (в отличие от некаталитических) характеризуются высокой чувствитель­ностью. Представим кинетическое уравнение каталитической реакции в следующем виде:

(4.58)

и преобразуем его в выражение С_{кат =} . (4.59)

Из уравнения (4.59) видно, что снизить С_кат можно следующими способами:

• снижать ∆x. Чтобы регистрировать очень малые изменения концентрации индикаторного вещества, надо использовать наиболее чувствительные способы измерения его концентрации;

• повышать ∆t, т. е. увеличить время наблюдения за протеканием индикаторной реакции;

• использовать оптимальные (как правило, высокие) концентрации реагентов А и В.

Наиболее эффективным приемом повышения чувствительности каталитических методов является увеличение константы скорости каталитической реакции (k) за счет введения активаторов, оптимизации рН раствора, повышения температуры, проведения процесса в водно-органических средах. Если в настоящее время в аналитических лабораториях используются методики, в которых определяют вещества-катализаторы на уровне 10^–12 –10^–10 М, то за счет перечисленных выше приемов можно определять еще меньшие концентрации. Главным преимуществом каталитических методов является сочетание уникальной чувствительности с простотой и дешевизной оборудования, необходимого для проведения анализа.

Реальную чувствительность каталитических методов ограничивает протекание (наряду с каталитической) некаталитической реакции, обусловленной наличием различных примесей в реактивах и воде или другом растворителе. Все это создает «фон», колебания которого ограничивают предел обнаружения катализатора. Уменьшить влияние фона возможно, используя реактивы и растворители высокой степени чистоты.

Варьируя условия проведения реакции (концентрации реаген­тов, рН, природу растворителя), используя активаторы и маскирующие вещества, можно добиться того, что катализатором в индикаторной реакции будет только одно соединение – определяемый компонент. Однако добиться этого удается не всегда. Каталитические методы используют для определе­ния микроколичеств металлов, прежде всего первого переходного ряда и группы плати­новых металлов, а также для определения некоторых анионов (I^–, Сl^–, Вr^–, S^2–). Органические вещества, особенно токсичные и лекарственные препараты, определяют как по их собственному каталитическому действию в индикаторных реакциях, так и по их ингибирующему или активирующему действию на ион металла-катализатора. Кинетические мето­ды используют в анализе биологических объектов и объ­ектов окружающей среды, в клиническом анализе, а в некоторых случаях – и в заводских лабораториях. При условии строгого соблюдения условий проведения анализа кинетические методы не уступают другим методам по точности, достаточ­но экспрессны, легко поддаются автоматизации. Реальная чувствительность определения многих веществ каталитическими методами сопоставима с чувствительностью масс-спектральных, активационных и хроматографических методов анализа. Но каталитические методы имеют важное преимущество: для них не требуется сложное и дорогое оборудование.