7.5. Хроматографический анализ. История и принцип метода
В
М.С. Цвет
(1872–1919)
Вытолкнув столбик мела из колонки, Цвет вырезал из него окрашенные зоны и экстрагировал из каждой соответствующий компонент хлорофилла для дальнейших исследований. Таким образом, задача быстрого и полного разделения смеси структурно-родственных веществ без применения высоких температур и химических реагентов была успешно решена.
Рис. 7.3. Схема опыта Цвета по хроматографическому разделению хлорофилла: А – начальный момент; Б – неполное разделение; В – полное разделение; Г – после разделения
Разделение компонентов смесей при их движении через твердую фазу ранее наблюдали и другие исследователи, но только М.С. Цвет понял значимость этого явления для аналитической химии. В своих докладах и статьях он указывал, что речь идет о принципиально новом методе разделения любых смесей, а не только о частной проблеме анализа хлорофилла. М.С. Цвет назвал этот метод хроматографией (от греческих слов хроматос – цвет и графо – писать) и предсказал, что хроматографию можно будет использовать для быстрого разделения не только окрашенных, но и бесцветных веществ, в том числе компонентов газовых смесей. Для полного разделения смеси достаточно будет даже небольшого различия в свойствах компонентов. К сожалению, при жизни Цвета, умершего в 1919 г., новый метод не получил признания.
В 30-е гг. ХХ века исследователи из разных стран вновь обратились к проблеме разделения смесей, особенно смесей органических веществ. Были созданы новые варианты хроматографии (это не умаляет роль Цвета как первооткрывателя метода в целом). В частности, было предложено вместо экстракционного извлечения компонентов из соответствующих зон внутренней хроматограммы полностью вымывать компоненты элюентом. Так как они выходят из колонки по очереди, в разное время, их можно собирать в отдельные приемники. Было показано также, что делить компоненты смесей можно не только в колонке, но и в тонком плоском слое сорбента (тонкослойная хроматография).
В 40–50-е гг. большой вклад в теорию и практику хроматографического анализа внесла группа исследователей, которой руководил английский аналитик А. Мартин1. Им была создана первая теория хроматографического разделения («теория тарелок»). Возможность разделения веществ удалось связать с различием их коэффициентов распределения между двумя фазами. Для хроматографического разделения было предложено использовать различия не только в адсорбционных, но и в других свойствах разделяемых веществ (например, различную растворимость). Был разработан метод бумажной хроматографии, где компоненты раствора разделялись, двигаясь вдоль полоски специальной бумаги. В 1952 г. Мартин и Джеймс создали и обосновали метод газожидкостной хроматографии. Вскоре были сконструированы первые приборы для разделения, идентификации и количественного определения компонентов сложных смесей. Эти приборы назвали хроматографами.
Любой хроматограф непрерывно регистрирует некоторое физическое свойство выходящего из колонки газа или раствора, таким образом получается внешняя хроматограмма. Каждый пик на хроматограмме соответствует выходу из колонки одного из компонентов смеси. Положение пика определяется природой компонента и может быть использовано для его опознания. Высота и площадь пика пропорциональны содержанию компонента в смеси, т. е. являются аналитическими сигналами. К концу 50-х гг. было налажено массовое производство хроматографов, они стали широко использоваться в контрольно-аналитических лабораториях.
Исследования в области хроматографического анализа продолжались и в последующие годы. Число научных публикаций в этой области ежегодно составляет около 30 % от общего числа публикаций в области аналитической химии. К концу ХХ века хроматография стала важнейшим способом контроля производства. По некоторым оценкам, ныне около 60 % всех химических анализов выполняется хроматографическим методом. Особенно широко применяются такие методы в нефтехимии, в пищевой промышленности, в клиническом и фармацевтическом анализе, а также в контроле загрязнения окружающей среды (анализ воздуха, природных и сточных вод). В частности, для определения токсичных металлов в природных водах широко применяют ионообменную хроматографию (см. раздел 7.5), для контроля состава сложных лекарственных препаратов – жидкостную, для определения пестицидов и других токсичных веществ – газожидкостную и т. д.
Рис. 7.4. Участок хроматограммы экстракта из мышечной ткани.
Здесь и далее на осях хроматограмм: I – сигнал детектора; τ – время с момента ввода пробы. Буквами отмечены пики пестицидов. Всего на хроматограмме имеется свыше ста пиков
Примером может быть хроматограмма экстракта из мышечной ткани птицы, полученная методом газожидкостной хроматографии с применением детектора электронного захвата (рис. 7.4). На хроматограмме отчетливо видны пики различных хлорорганических пестицидов. Эти вещества попали в организм птицы в результате техногенного загрязнения окружающей среды.
Общие закономерности хроматографии. Термин хроматография шире, чем термин хроматографический анализ. Дело в том, что хроматографию как метод разделения веществ применяют не только в анализе. Хроматографическими методами исследуют свойства поверхностей, устанавливают структуру молекул и изучают их свойства. Препаративные хроматографы позволяют выделять активные компоненты (например, лекарственные вещества) из природного сырья или сложной смеси продуктов органического синтеза, а затем и концентрировать эти компоненты. Появились даже заманчивые технологические проекты хроматографических разделений в многотоннажном промышленном производстве (например, для фракционирования нефти), хотя идея «хроматографических заводов» пока не реализована.
Варианты хроматографического анализа многочисленны и весьма различны, но все они имеют два общих признака:
хроматографическое разделение происходит при перемещении смеси (например, анализируемой пробы) сквозь слой неподвижного сорбента. Таким образом, в любом методе есть подвижная фаза (ПФ), проходящая через неподвижную фазу (НФ). При этом НФ замедляет перемещение компонентов подвижной фазы (пробы);
компоненты пробы обратимо распределяются между ПФ и НФ, причем по мере движения ПФ через НФ процесс распределения многократно повторяется. Компоненты, имеющие разные коэффициенты распределения, движутся с разной скоростью и постепенно разделяются.
Основываясь на этих признаках, введем определение: хроматография – физико-химический метод разделения и анализа, основанный на многократном перераспределении компонентов смеси между двумя фазами – подвижной и неподвижной.
Скорость движения компонента через неподвижную фазу (w) тем больше, чем больше скорость движения подвижной фазы (u) и чем меньше коэффициент распределения этого компонента (Г) между подвижной и неподвижной фазами. Довольно точно описывает экспериментальные данные формула (7.11), учитывающая соотношение объемов НФ (сорбента) и ПФ (элюента):
w ≈
. (7.11)
Если в хроматографической колонке объемы ПФ и НФ приблизительно одинаковы, а коэффициент распределения намного больше единицы, то для двух веществ, имеющих неодинаковые коэффициенты распределения:
. (7.12)
Таким образом, чем сильнее удерживается некоторый компонент пробы неподвижной фазой, тем медленнее он будет двигаться через нее и тем позже выйдет из колонки с сорбентом. Время удерживания компонента (t) будет тем больше, чем больше коэффициент распределения. Компоненты смеси нельзя разделить, если они имеют одинаковые коэффициенты распределения. Значения коэффициентов, а следовательно, и скорости движения компонентов не должны зависеть от их концентрации, а также от присутствия других компонентов той же пробы. Однако формула (7.11), иногда называемая основным уравнением газоадсорбционной хроматографии, и другие приведенные выше формулы сильно идеализированы, они выполняются лишь при определенных условиях (см. раздел 7.9).
Классификации хроматографических методов. Методы хроматографического анализа можно классифицировать по разным признакам. Так, классический метод Цвета – это адсорбционная колоночная элюентная жидкостная хроматография.
Наиболее важна классификация по агрегатному состоянию подвижной фазы. В этом случае выделяют методы газовой, жидкостной и флюидной1 хроматографии. Более детальная классификация учитывает и природу неподвижной фазы (см. табл. 7.1). Так, внутри газовой хроматографии выделяют газожидкостную и газотвердофазную хроматографии, аналогичным образом выделяют разные варианты жидкостной хроматографии.
Учитывая цель разделения компонентов, выделяют аналитические и препаративные варианты хроматографии. Масса разделяемой смеси в препаративной хроматографии гораздо больше, чем в аналитической.
Можно учесть технику метода, в частности, способ размещения неподвижной фазы. В колоночной хроматографии неподвижная фаза находится внутри тонкой и длинной колонки, через которую под давлением пропускают газ или жидкость. Частный случай колоночной хроматографии – капиллярная хроматография, в этом случае длина колонки может достигать нескольких сотен метров при внутреннем диаметре порядка 1 мм. Напротив, в тонкослойной (ТСХ) и бумажной хроматографии неподвижная фаза – плоский слой пористого материала, сквозь который жидкость движется благодаря силам поверхностного натяжения.
Еще один способ классификации учитывает состав подвижной фазы. В частности, в элюентной хроматографии ПФ – поток непрерывно подаваемого в колонку чистого инертного газа (газа-носителя) или жидкого растворителя (элюента). Именно так делил компоненты хлорофилла М.С. Цвет. Элюентная хроматография позволяет полностью разделить компоненты смеси, но их концентрация в ходе разделения сильно понижается, что нежелательно. Другие способы хроматографирования (фронтальный и вытеснительный) не ведут к сильному разбавлению пробы. В первом случае подвижной фазой служит сама анализируемая смесь, во втором – вспомогательное вещество, которое сильнее поглощается неподвижной фазой, чем все компоненты смеси, и вытесняет их из колонки. Однако полное разделение компонентов пробы в обоих случаях не достигается. Поэтому такие варианты в современной практике хроматографического анализа применяют довольно редко. В дальнейшем будет рассматриваться лишь наиболее распространенный метод – элюентная хроматография.
Часто используется классификация методов по механизму разделения веществ. Разная скорость движения компонентов пробы через неподвижную фазу может объясняться:
различиями в адсорбционных свойствах молекул при их поглощении поверхностью твердой неподвижной фазы (адсорбционная хроматография);
неодинаковой растворимостью компонентов в неподвижной жидкой фазе (распределительная хроматография);
разной способностью компонентов к ионному обмену (ионообменная хроматография);
различным размером молекул (молекулярно-ситовая хроматография).
Этот перечень можно продолжать и далее, так как известно около двух десятков разных механизмов взаимодействия компонентов пробы с неподвижной фазой, но перечисленные выше четыре механизма встречаются чаще всего. Механизм взаимодействия компонентов пробы с неподвижной фазой определяет, какие смеси можно делить в том или ином случае. Например, распределительную газожидкостную хроматографию преимущественно используют для разделения легко испаряемых органических соединений, молекулярно-ситовую – для анализа смесей природных полимеров (белков, полисахаридов и т. п.), а ионообменную – для определения ионов в водных растворах сложного состава. Иногда реальный хроматографический процесс имеет смешанный механизм, возможность разделения компонентов смеси определяется сразу двумя-тремя факторами (например, и размером молекул, и их адсорбционными свойствами).
Механизм взаимодействия компонентов пробы с неподвижной фазой нередко остается неизвестным непосредственным исполнителям анализа, что не мешает им получать точные результаты. Теоретические аспекты разделения веществ являются общими для всех видов хроматографии. Вид и способы обработки хроматограмм, практические приемы проведения качественного и количественного анализа, а иногда и используемая в ходе анализа аппаратура зачастую тоже не зависят от механизма разделения компонентов. Знать его надо в основном для разработки новых и оптимизации известных методик анализа.