4.8.2. Ферментативные и иммунохимические методы

Среди каталитических методов наиболее высокой чувствительностью и селек­тивностью обладают ферментативные методы, основанные на использова­нии реакций, катализируемых ферментами – биологическими катализа­торами, ускоряющими химические процессы в живых организмах и вне их. Эти методы стали применяться в аналитических лабораториях в 70-е гг. XX века. С их помощью можно определять сами ферменты, их субстраты (т. е. соединения, превращения которых катализируют ферменты), а также соединения, воздействующие на каталитическую активность ферментов, – их эффекторы (активаторы или ингибиторы).

Ферменты обладают уникальными свойствами, которые отличают их от других катализаторов. Прежде всего, это необычайно высокая каталитическая активность. Добавка очень незначительного количества фермента (10^–9–10^–7 М) иногда ускоряет превращение субстрата в 10⁸–10¹² раз. Другое важное свойство – специфичность действия ферментов в отношении структуры субстрата, типа индикаторной реакции и условий ее проведения. Специфичность фермента – это прежде всего его способность ускорять превращение только одного типа субстратов (например, одноатомных спиртов), а иногда – только какого-либо одного субстрата. Так, фермент уреаза катализирует только гидролиз мочевины. Вместе с тем эффективно влияет на скорость этой индикаторной реакции только уреаза. Специфичность взаимодействия в паре фермент-субстрат, неоднократно сопоставлявшаяся со специфичностью пары «ключ–замок», обусловлена сложной структурой и весьма сложным механизмом действия фермента.

Ферменты – сложные белковые молекулы, представляющие собой высокомолекулярные соединения, состоящие из -L-аминокислот, связанных друг с другом пептидными (амидными) связями. Белковая часть фермента (апофермент) может быть связана с небелковыми компонентами (кофакторами); такой комплекс называется холоферментом. Основной частью фермента, определяющей его каталитические свойства, является активный центр – участок белковой молекулы, на котором происходит превращение субстрата (рис. 4.17). Иногда в активном центре фермента выделяют участок, связывающий субстрат, и каталитический участок, содержащий каталитически активные группы белка (кофакторы). Часто эти участки совпадают. Как правило, активный центр находится в углублении («кармане») белковой глобулы, размерам и форме которого должна соответствовать молекула субстрата. Для многих ферментов характерно наличие регуляторных участков, которые взаимодействуют с веществами, влияющими на активность фермента, т. е. активаторами или ингибиторами.

Механизм действия ферментов включает сорбцию субстрата на активном центре фермента и образовании активного комплекса (фермент-субстрат) в результате гидрофобных, полярных и ионных взаимодействий. В этом комплексе происходит сближение и ориентация реагирующих групп фермента и субстрата. Взаимодействие между ферментом и сорбированным субстратом носит полифункциональный характер, при котором молекула субстрата подвергается атаке сразу нескольких каталитических групп активного центра фермента, что и обусловливает его высокую каталитическую активность.

Рис. 4.17. Процессы в активном центре фермента (превращение субстрата S в продукты РР) и его регуляторных участках (взаимодействие с ингибитором и активатором)

Скорость реакций с участием ферментов можно измерять разными способами. Чаще всего применяют фотометрические методы. При этом в качестве индикаторных используют катализируемые пероксидазой и другими оксидазами (ферментами, катализирующими окислительно-восстанови- тельные реакции), а также гидролизами (катализирующими реакции гидролиза) реакции образования окрашенных продуктов. Исключительно высокой чувствительностью отличаются хемилюминесцентные методы контроля ферментативных реакций. Контролировать скорость биохимических реакций, протекающих с поглощением или выделением протонов, а также окислительно-восстановительных процессов, сопровождающихся поглощением кислорода или образованием Н₂О₂, удобно электрохимическими методами (потенциометрия, амперометрия и т. д.).

Скорость ферментативных процессов зависит от концентрации целого ряда веществ (фермента, субстрата, эффекторов), а также от величины рН и температуры. Градуировочным графиком будет зависимость скорости реакции от концентрации одного из участников (фермента, или субстрата, или эффектора). Остальные факторы должны быть строго постоянны. Но в ферментативном анализе градуировочные графики строят редко, чаще применяют способ фиксированного времени. Для определения субстратов или эффекторов знать точную концентрацию соответствующих ферментов не обязательно, достаточно во все пробы (и эталоны) вводить одно и то же количество ферментсодержащего раствора. Поэтому в ферментативном анализе вначале основное внимание уделялось количественному определению субстратов. Примеры – определение глюкозы или холестерина в крови. Эти показатели важны для диагностики и для контроля лечения ряда заболеваний, например диабета или атеросклероза. Еще больше работ посвящено методам определения эффекторов – как неорганических (ионы тяжелых металлов, прежде всего ионы ртути; разные анионы, например фториды), так и органических. Например, фосфорсодержащие пестициды определяют по ингибированию ими фермента холинэстеразы; различные фенолы определяют с помощью пероксидазы. Методы определения эффекторов, хотя и менее селективны, но более чувствительны, чем методы определения субстратов. Так, пределы обнаружения многих субстратов находятся в диапазоне 10^–6–10^–4 М, а органических эффекторов – 10^–11–10^–8 М, причем число эффекторов ферментов значительно больше, чем число их субстратов.

При практическом использовании ферментов важно учитывать их стабильность, т. е. способность сохранять активность в течение длительного времени. При хранении и особенно в ходе ферментативной реакции фермент может частично или полностью терять свою каталитическую активность, другими словами, инактивироваться. Одним из эффективных способов стабилизации ферментов является их иммобилизация, т. е. перевод в водонерастворимое состояние путем связывания с носителем или модифицирование растворимыми в воде полимерами с полным или частичным сохранением ферментами каталитической активности. Повышение стабильности и возможность многократного использования иммобилизованных ферментов значительно снижают стоимость ферментативных методов анализа.

Ферментативные методы находят широкое применение в анализе самых разнообразных объектов – медицинских (биологических жидкостей, тканей живых организмов), пищевых продуктов, фармацевтических препаратов; для непрерывного контроля микробиологических и биохимических процессов в производстве. Методы используют для определения токсичных органических и неорганических соединений в объектах окружающей среды – сточных, природных водах (речных, морских, подземных), почвах, воздухе, листьях растений.

Иммунохимические методы. К биохимическим методам, кроме ферментативных, относят и иммунохимические методы. Напомним, что генетически чужеродные вещества, попадая в организмы высших животных и человека, способны вызывать в них ряд специфических процессов, направленных на удаление этих веществ из организма. Система, регулирующая эти специфические процессы, называется иммунной, а сами процессы – иммунологическими. Вещества, способные вызывать специфические иммунологические реакции в организме, в том числе биосинтез специфических антител, называют антигенами. К антигенам относятся, в частности, белки, полисахариды, нуклеиновые кислоты. Важнейший иммунологический процесс – образование специфических белков крови – антител (иммуноглобулинов). Биологическая функция антител состоит в защите организма от чужеродных веществ (антигенов) путем их распознавания, специфического связывания в прочные иммунные комплексы и удаления их из организма. Таким образом, иммунохимические методы анализа основаны на специфическом связывании определяемого соединения – антигена – соответствующими антителами. Иммунохимическая реакция представляет собой сложный процесс, протекающий в несколько стадий. В иммунохимическом анализе принципиально возможно использование только первой стадии – обратимого образования комплекса (антиген-антитело) состава 1:1. Классические методы иммунохимического анализа основаны на образовании осадка при взаимодействии антител с антигенами. За протеканием этого процесса обычно наблюдают визуально и обнаруживают или полуколичественно определяют относительно высокие концентрации компонентов. Эти методы длительны и трудоемки.

В самом конце XX века возник другой вариант иммунохимического анализа – иммуноферментный метод (к числу кинетических методов его не относят). Высокая чувствительность кинетического определения ферментов удачно сочетается в этом случае с уникальной специфичностью иммунохимического взаимодействия определяемых веществ (антигенов) с вырабатываемыми организмом антителами. Создание экспрессных и высокочувствительных иммуноферментных методов определения белков, гормонов, стероидов, наркотических и лекарственных веществ, вирусов и отдельных клеток было очень важно для клинического (биохимического) анализа. Оно также позволило к началу XXI века разработать иммуноферментные тест-системы для микробиологической, фармакологической и пищевой промышленности, для ветеринарии и сельского хозяйства, а также для контроля загрязнения окружающей среды.